【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术的各个方面至少涉及微生物学、遗传学和生物。
技术介绍
1、酵母是用于产生重组蛋白的理想宿主，因为其快速的生长、达到较高细胞密度的能力、在确定的最小培养基上生长、实现较高蛋白产率并进行真核翻译后修饰。与蛋白质生产最相关的酵母是巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)(巴斯德驹形氏酵母(komagataellapastoris)、法夫驹形氏酵母(komagataella phaffii))，因为基因组信息和基因组操作的分子工具广泛可用性。这些使得人们能够根据fda标准使用巴斯德毕赤酵母进行gras成分的生产。
2、对于各种生物技术应用，通常优选产生被分泌到生长培养基中以简化回收的蛋白质。巴斯德毕赤酵母能够分泌活性重组蛋白，同时保持内源性蛋白的低水平分泌。
3、在真核生物中，分泌的蛋白质首先通过转运从细胞质靶向内质网腔(lumenendoplasmic reticulum,er)。进入内质网的转运既可以发生在翻译后(即多肽链合成后)，也可以发生在共翻译(即mrna翻译成其氨基酸序列期间)中。翻译后转运需要在细胞质中保持多肽链处于松散构象的分子伴侣，以及内质网驻留分子伴侣kar2的作用，kar2充当分子棘轮(molecular ratchet)。因此，该过程可能受到部分折叠结构域和/或细胞质聚集的阻碍。因此，对于生物技术应用，需要促进共翻译转运。一旦处于内质网中，蛋白质就会被糖基化，它们的二硫键被异构化，然后它们折叠到它们的天然状态。成功折叠的蛋白质然后转运到高尔基复合体，在那里发生进一步的糖基
4、蛋白质向分泌途径的靶向是由分泌肽介导。巴斯德毕赤酵母中使用最广泛的是酿酒酵母的交配因子α的前导肽。它由两个不同的区域组成：ii)前19个氨基酸的前区域(pre-region)，其促进翻译后转运并在进入内质网时被切割；2)70个氨基酸的原区段(pro-segment)，其用作内质网到高尔基体的输出信号，并在高尔基体中于在双碱性氨基酸切割位点kr处切割。
5、存在对合成的分泌信号肽的需求，以实现较高的蛋白质的细胞外生产。
技术实现思路
1、本公开内容的各个方面通过提供新的分泌信号肽来满足某些需求，这些肽可有效提高蛋白质的细胞外生产，包括哺乳动物蛋白质，例如人乳蛋白。本公开内容的某些方面(至少部分地)基于信号肽的开发，所述信号肽是由巴斯德毕赤酵母(p.pastoris)的前-分泌肽(来自i)er腔的寡糖转移酶复合物的α亚基(ost1)或ii)gpi锚定蛋白pst1)与(i)酿酒酵母交配因子的或ii)巴斯德毕赤酵母epx1的)原-区域的框内融合产生。因此，本文中描述的是编码这种分泌信号肽的分离的核酸，在某些情况下与重组蛋白(如人乳蛋白)连接，以及包括这种核酸的细胞以及用于从这种细胞中产生和收集重组蛋白的方法。
2、在一些实施方案中，本文中描述的是编码多肽的分离的核酸，其包括与seq idno:1、2、3或4具有至少90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，序列包括seq id no:1、2、3或4。在一些实施方案中，多肽还包括哺乳动物蛋白质的序列。在一些实施方案中，哺乳动物蛋白是人乳蛋白。在一些实施方案中，人乳蛋白是分泌性iga(siga)、黄嘌呤脱氢酶、乳铁蛋白、乳过氧化物酶、嗜乳脂蛋白(butyrophilin)、乳粘素(lactadherin)、脂联素、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、瘦素、溶菌酶或α-乳清蛋白。在一些实施方案中，人乳蛋白是人乳铁蛋白。
3、在一些实施方案中，该序列与seq id no:1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些实施方案中，序列包括seq id no:1。在一些实施方案中，分离的核酸包括与seq id no:41具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，核酸序列包括seq id no:41。在一些实施方案中，多肽包括seq id no:5。在一些实施方案中，分离的核酸包括与seq id no:46具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，核酸序列包括seq id no:46。
4、在一些实施方案中，该序列与seq id no:2具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些实施方案中，该序列包括seq id no:2。在一些实施方案中，分离的核酸包括与seq id no:42具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，核酸序列包括seq id no:42。在一些实施方案中，多肽包括seq id no:6。在一些实施方案中，分离的核酸包括与seq id no:47具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，核酸序列包括seq idno:47。
5、在一些实施方案中，该序列与seq id no:3具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些实施方案中，该序列包括seq id no:3。在一些实施方案中，分离的核酸包括与seq id no:43具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，核酸序列包括seq id no:43。在一些实施方案中，多肽包括seq id no:7。在一些实施方案中，分离的核酸包括与seq id no:48具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，核酸序列包括seq idno:48。
6、在一些实施方案中，该序列与seq id no:4具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些实施方案中，该序列包括seq id no:4。在一些实施方案中，分离的核酸包括与seq id no:44具有至少80％、81％、82％、8本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种编码多肽的分离的核酸，所述多肽包括与SEQ ID NO:1、2、3或4具有至少90％序列同一性的序列。
2.根据权利要求1所述的分离的核酸，其中所述序列包括SEQ ID NO:1、2、3或4。
3.根据权利要求1或2所述的分离的核酸，其中所述多肽还包括哺乳动物蛋白质的序列。
4.根据权利要求3所述的分离的核酸，其中所述哺乳动物蛋白为人乳蛋白。
5.根据权利要求4所述的分离的核酸，其中所述人乳蛋白为分泌性IgA(sIgA)、黄嘌呤脱氢酶、乳铁蛋白、乳过氧化物酶、嗜乳脂蛋白、乳粘素、脂联素、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、瘦素、溶菌酶或α-乳清蛋白。
6.根据权利要求5所述的分离的核酸，其中所述人乳蛋白为人乳铁蛋白。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的分离的核酸，其中所述序列与SEQ ID NO:1具有至少90％的序列同一性。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的分离的核酸，其中所述序列包括SEQ ID NO:1。
9.根据权利要求8所述的分离的核酸，其中所述分离的核酸包括与SEQ ID
10.根据权利要求9所述的分离的核酸，其中所述核酸序列包括SEQ ID NO:41。
11.根据权利要求8所述的分离的核酸，其中所述多肽包括SEQ ID NO:5。
12.根据权利要求11所述的分离的核酸，其中所述分离的核酸包括与SEQ ID NO:46具有至少80％同一性的核酸序列。
13.根据权利要求12所述的分离的核酸，其中所述核酸序列包括SEQ ID NO:46。
14.根据权利要求1-6中任一项所述的分离的核酸，其中所述序列与SEQ ID NO:2具有至少90％的序列同一性。
15.根据权利要求1-6中任一项所述的分离的核酸，其中所述序列包括SEQ ID NO:2。
16.根据权利要求15所述的分离的核酸，其中所述分离的核酸包括与SEQ ID NO:42具有至少80％同一性的核酸序列。
17.根据权利要求16所述的分离的核酸，其中所述核酸序列包括SEQ ID NO:42。
18.根据权利要求15所述的分离的核酸，其中所述多肽包括SEQ ID NO:6。
19.根据权利要求18所述的分离的核酸，其中所述分离的核酸包括与SEQ ID NO:47具有至少80％同一性的核酸序列。
20.根据权利要求19所述的分离的核酸，其中所述核酸序列包括SEQ ID NO:47。
21.根据权利要求1-6中任一项所述的分离的核酸，其中所述序列与SEQ ID NO:3具有至少90％的序列同一性。
22.根据权利要求1-6中任一项所述的分离的核酸，其中所述序列包括SEQ ID NO:3。
23.根据权利要求22所述的分离的核酸，其中所述分离的核酸包括与SEQ ID NO:43具有至少80％同一性的核酸序列。
24.根据权利要求23所述的分离的核酸，其中所述核酸序列包括SEQ ID NO:43。
25.根据权利要求22所述的分离的核酸，其中所述多肽包括SEQ ID NO:7。
26.根据权利要求25所述的分离的核酸，其中所述分离的核酸包括与SEQ ID NO:48具有至少80％同一性的核酸序列。
27.根据权利要求26所述的分离的核酸，其中所述核酸序列包括SEQ ID NO:48。
28.根据权利要求1-6中任一项所述的分离的核酸，其中所述序列与SEQ ID NO:4具有至少90％的序列同一性。
29.根据权利要求1-6中任一项所述的分离的核酸，其中所述序列包括SEQ ID NO:4。
30.根据权利要求29所述的分离的核酸，其中所述分离的核酸包括与SEQ ID NO:44具有至少80％同一性的核酸序列。
31.根据权利要求30所述的分离的核酸，其中所述核酸序列包括SEQ ID NO:44。
32.根据权利要求32所述的分离的核酸，其中所述多肽包括SEQ ID NO:8。
33.根据权利要求32所述的分离的核酸，其中所述分离的核酸包括与SEQ ID NO:49具有至少80％同一性的核酸序列。
34.根据权利要求33所述的分离的核酸，其中所述核酸序列包括SEQ ID NO:49。
35.一种载体，包括权利要求1-34中任一项所述的核酸。
36.一种工程化的真核细胞，包括权利要求1-34中任一项所述的核酸...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种编码多肽的分离的核酸，所述多肽包括与seq id no:1、2、3或4具有至少90％序列同一性的序列。
2.根据权利要求1所述的分离的核酸，其中所述序列包括seq id no:1、2、3或4。
3.根据权利要求1或2所述的分离的核酸，其中所述多肽还包括哺乳动物蛋白质的序列。
4.根据权利要求3所述的分离的核酸，其中所述哺乳动物蛋白为人乳蛋白。
5.根据权利要求4所述的分离的核酸，其中所述人乳蛋白为分泌性iga(siga)、黄嘌呤脱氢酶、乳铁蛋白、乳过氧化物酶、嗜乳脂蛋白、乳粘素、脂联素、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、瘦素、溶菌酶或α-乳清蛋白。
6.根据权利要求5所述的分离的核酸，其中所述人乳蛋白为人乳铁蛋白。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的分离的核酸，其中所述序列与seq id no:1具有至少90％的序列同一性。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的分离的核酸，其中所述序列包括seq id no:1。
9.根据权利要求8所述的分离的核酸，其中所述分离的核酸包括与seq id no:41具有至少80％同一性的核酸序列。
10.根据权利要求9所述的分离的核酸，其中所述核酸序列包括seq id no:41。
11.根据权利要求8所述的分离的核酸，其中所述多肽包括seq id no:5。
12.根据权利要求11所述的分离的核酸，其中所述分离的核酸包括与seq id no:46具有至少80％同一性的核酸序列。
13.根据权利要求12所述的分离的核酸，其中所述核酸序列包括seq id no:46。
14.根据权利要求1-6中任一项所述的分离的核酸，其中所述序列与seq id no:2具有至少90％的序列同一性。
15.根据权利要求1-6中任一项所述的分离的核酸，其中所述序列包括seq id no:2。
16.根据权利要求15所述的分离的核酸，其中所述分离的核酸包括与seq id no:42具有至少80％同一性的核酸序列。
17.根据权利要求16所述的分离的核酸，其中所述核酸序列包括seq id no:42。
18.根据权利要求15所述的分离的核酸，其中所述多肽包括seq id no:6。
19.根据权利要求18所述的分离的核酸，其中所述分离的核酸包括与seq id no:47具有至少80％同一性的核酸序列。
20.根据权利要求19所述的分离的核酸，其中所述核酸序列包括seq id no:47。
21.根据权利要求1-6中任一项所述的分离的核酸，其中所述序列与seq id no:3具有至少90％的序列同一性。
22.根据权利要求1-6中任一项所述的分离的核酸，其中所述序列包括seq id no:3。
23.根据权利要求22所述的分离的核酸，其中所述分离的核酸包括与seq id no:43具有至少80％同一性的核酸序列。
24.根据权利要求23所述的分离的核酸，其中所述核酸序列包括seq id no:43。
25.根据权利要求22所述的分离的核酸，其中所述多肽包括seq id no:7。
26.根据权利要求25所述的分离的核酸，其中所述分离的核酸包括与seq id no:48具有至少80％同一性的核酸序列。
27.根据权利要求26所述的分离的核酸，其中所述核酸序列包括seq id no:48。
28.根据权利要求1-6中任一项所述的分离的核酸，其中所述序列与seq id no:4具有至少90％的序列同一性。
29.根据权利要求1-6中任一项所述的分离的核酸，其中所述序列包括seq id no:4。
30.根据权利要求29所述的分离的核酸，其中所述分离的核酸包括与seq id no:44具有至少80％同一性的核酸序列。
31.根据权利要求30所述的分离的核酸，其中所述核酸序列包括seq id no:44。
32.根据权利要求32所述的分离的核酸，其中所述多肽包括seq id no:8。
33.根据权利要求32所述的分离的核酸，其中所述分离的核酸包括与seq id no:49具有至少80％同一性的核酸序列。
34.根据权利要求33所述的分离的核酸，其中所述核酸序列包括seq id no:49。
35.一种载体，包括权利要求1-34中任一项所述的核酸。
36.一种工程化的真核细胞，包括权利要求1-34中任一项所述的核酸或权利要求35所述的载体。
37.根据权利要求36所述的工程化的真核细胞，其中所述细胞为真菌细胞。
38.根据权利要求37所述的工程化的真核细胞，其中所述真菌细胞为arxula、曲霉属(aspegillus)、裂殖壶菌属(aurantiochytrium)、念珠菌属(candida)、麦角菌属(claviceps)、隐球菌属(cryptococcus)、小克银汉霉属(cunninghamella)、地丝菌属(geotrichum)、汉逊酵母属(hansenula)、克鲁维酵母...
【专利技术属性】
技术研发人员：P·博特罗·贝萨达隆巴纳，L·卡茨，
申请(专利权)人：赫莱纳公司，
类型：发明
国别省市：
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