植物雄性不育系及其恢复系的培育方法技术

本发明专利技术公开了一种植物雄性不育系及其恢复系的培育方法。该方法，是将含有一表达盒的重组表达载体导入目的植物中得到所述雄性不育系植物；所述表达盒从上游至下游依次包括：ｌｏｘｐ位点、花药或雄蕊器官原基特异启动子、乙烯受体ＥＴＲ１蛋白的编码基因的反向互补基因、终止子和ｌｏｘｐ位点。本发明专利技术还构建了上述不育系的恢复系，是将Ｃｒｅ基因导入上述目的植物中，得到恢复系。实验证明：将恢复系和不育系杂交后，恢复Ｆ１代的育性，由此创造一个新的，具有自主知识产权（不育系创制方法）、同时方便可行的雄性不育与杂种优势利用的技术体系。该发明专利技术将基础研究的发现转换为应用领域，为发掘杂种优势应用潜力和今后的精确育种提供了新的视角和经验。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及。
技术介绍
从上世纪70年代以来，杂种优势利用为我国水稻生产做出了重大的贡献。面临我 国经济发展对农业生产所提出“高产、优质、高效、安全、生态”的新的重大需求，能否进一步 发掘杂种优势的应用潜力以应对，就成为摆在当代科学家面前的一个严峻挑战。杂种优势的形成基于两个不同亲本的组合。要在现有应用的基础上进一步发掘其 潜力，除了需要加强杂种优势形成机制的研究之外，还急需建立有效的方法来创造雄性不 育性状，以便有效扩大杂交组合的筛选和优秀组合在生产上的应用。目前，在育种工作和生产上广泛应用的雄性不育性状多来自于自然突变及其性状 转育株系。雄性不育性状的来源十分有限，是扩大杂交组合筛选特别是应用的严重制约因 子。虽然在20世纪90年代初美国科学家就已经证明通过生物技术的方法可以创制人工控 制的雄性不育性状，但是，按照目前国际通行的规则，所有具有应用潜力的创新都受到知识 产权保护。因此，寻找新的、具有自主知识产权的创制人工控制雄性不育性状的思路和方 法，已经成为希望把握发掘杂种优势应用潜力主动权的国家和地区所面临的无法回避、亟 待解决的关键问题之一。长期以来，人们一直利用常规育种的方法选育不育系，或者把不育性从一个品种 转育到另一个品种中，这些方法周期长、见效慢，不能满足生产发展的迫切需要。目前，也有 许多控制植物雄性不育性的基因被克隆，但是由于植物的不育性受核基因、线粒体基因、叶 绿体基因和环境因素的影响，作用机理比较复杂，人们对其认识还不足，所以难在短期内获 得明显的效果，基因工程雄性不育与用常规方法选育雄性不育相比具有一些特点选育周 期缩短，育性相对稳定，受环境影响小，对基因型依赖少，环境污染少。Mariani等人在1990 年开创了一个创造植物雄性不育的新途径。他们应用来自于烟草的花药绒毡层特异启动子 (TA29)和核糖核酸酶基因(Barnase)嵌合后转化烟草和油菜，由于核糖核酸酶的作用，转 基因烟草和油菜的花药绒毡层被破坏，形成花粉败育，而转基因烟草的其他器官发育正常。 目前除了 Barnase基因以外，还有许多其他功能基因被应用于基因工程雄性不育的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种培育雄性不育系植物的方法。本专利技术提供的培育雄性不育系植物的方法，是将含有如下表达盒的重组表达载体 导入目的植物中得到所述雄性不育系植物从上游至下游依次包括loxp位点、花药或雄 蕊器官原基特异启动子、乙烯受体ETRl蛋白的编码基因的反向互补基因、终止子和Ioxp位点ο进一步，上述表达盒中，Ioxp位点的核苷酸序列如序列表中序列3的第7-40位所 示、花药或雄蕊器官原基特异启动子的核苷酸序列如序列表中序列1所示、乙烯受体ETRl3蛋白的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。更进一步，上述重组表达载体的构建方法是将所述启动子和所述乙烯受体ETRl蛋白的编码基因的反向互补基因插入一中间 载体的多克隆位点间(具体是启动子插入EcoRI和SacI位点间；乙烯受体ETRl蛋白的编 码基因的反向互补基因插入BglII和SpeI位点间)，得到所述重组表达载体； 所述中间载体是将序列表中序列3所示的片段插入PCAMB2300质粒的多克隆位点 间(如pvsl sta和SmaI酶切位点间)，得到所述中间载体。上述目的植物为双子叶植物或单子叶植物，优选是拟南芥。本专利技术另一目的在于提供一种培育上述方法得到的不育系的恢复系的方法。本专利技术提供的培育上述恢复系的方法是，是将Cre基因导入上述目的植物中，得 到所述恢复系，所述Cre基因的核苷酸序列如序列表中序列4所示。具体地讲，上述Cre基因是通过一表达载体导入植物中的所述表达载体是将序 列表中序列4所示的Cre基因片段插入pCAMBIA2300的多克隆位点间(如XbaI和BamHI 酶切位点间)，得到所述表达载体。本专利技术利用CRE/loxP位点特异性重组系统，在IoxP位点的两端连接器官特异性 启动子AP3介导的反义ETR1，成功构建转基因拟南芥雄性不育系；将构建的带有35S启动 子介导的CRE基因的拟南芥恢复系与上述转基因雄性不育系杂交，删除拟南芥Fl代中的不 育基因，恢复拟南芥Fl代的育性(表4)。本专利技术对构建的转基因拟南芥不育系花器官的形态观察，亚历山大染色镜检花 粉，花粉萌发实验发现转基因拟南芥不育系花丝明显缩短，花药萎缩，可育花粉大量减少， 花粉无法正常萌发(萌发率仅为2. 67% )，结实率相对于对照植株明显降低，育性表现为半 不育或全不育。而Fl代表现为育性恢复。这样，利用CRE/loxP系统，我们可以人工构建雄性不育系和恢复系，形成利用雄 性不育，创建新的种质资源的方法。本专利技术是将基础研究的发现(器官特异性ETRl表达下调可导致雄性不育)转换 为应用领域具有源头创新性的新思路和新方法，为发掘杂种优势应用潜力和今后的精确育 种积累了新的经验。附图说明图1为AP3启动子的电泳图；M为Marker 15000 ；1 以野生型拟南芥总基因组DNA 为模版扩增的AP3启动子片段。图2为aETRl基因(简称ETR1)的获得，M =Marker 2000plus ；1 以野生型拟南芥 总RNA反转录后的cDNA为模板扩增的ETRl片段。图 3 为中间载体 IoxP-MCS-IoxP (pCAMBIA2300)的验证，M =Marker 15000 ；1 IoxP-MCS-IoxP(pCAMBIA2300)质粒为模版扩增的 loxP-MCS-loxP 片段(156bp)。图 4 为重组表达载体 loxP-PAP3 :antiETRl_loxP(pCAMBIA2300)图谱。图 5 为 loxP-PAP3: :antiETRl-loxP(pCAMBIA2300)载体验证 M :Marker 2000plus ；1 以1οχΡ-ΡΑΡ3: antiETRl-loxP质粒为模版扩增的AP3启动子片段 (727bp)2 :1οχΡ-ΡΑΡ3: antiETRl-loxP 质粒为模版扩增的 AtETRl 片段(2217bp)3 loxP-PAP3: :antiETRl-loxP质粒为对象，双酶切得到AP3启动子酶切产物；4 loxP-PAP3: :antiETRl-loxP质粒电泳图；5 以 1οχΡ_ΡΑΡ3: antiETRl_loxP质粒为对象，双 酶切得到PAP3 :antiETRl片段；6 以1οχΡ_ΡΑΡ3: antiETRl-loxP质粒为对象，双酶切得到 ETRl基因片段。图6为阳性转1οχΡ-ΡΑΡ3: antiETRl-loxP基因拟南芥苗潮霉素抗性筛选图片。图7为阳性转1οχΡ-ΡΑΡ3: antiETRl-loxP基因拟南芥基因组鉴定，M Marker2000plus ； 1-9 具不育表型的阳性转基因拟南芥的基因组为模板PCR扩增；10-13 无不育表型的转基因阳性拟南芥的基因组PCR扩增；14 以野生型拟南芥基因组为模板PCR 扩增(对照)。图8为阳性转1οχΡ-ΡΑΡ3: antiETRl-loxP拟南芥的表型观察，A，E 拟南芥花序 上花；(左野生型。右转基因拟南芥)B，F 花序下第一朵花；(左野生型。右转基因拟 南芥)C，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种培育雄性不育系植物的方法，是将含有如下表达盒的重组表达载体导入目的植物中得到所述雄性不育系植物：从上游至下游依次包括：ｌｏｘｐ位点、花药或雄蕊器官原基特异启动子、乙烯受体ＥＴＲ１蛋白的编码基因的反向互补基因、终止子和ｌｏｘｐ位点。

【技术特征摘要】
一种培育雄性不育系植物的方法，是将含有如下表达盒的重组表达载体导入目的植物中得到所述雄性不育系植物从上游至下游依次包括loxp位点、花药或雄蕊器官原基特异启动子、乙烯受体ETR1蛋白的编码基因的反向互补基因、终止子和loxp位点。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述表达盒中，Ioxp位点的核苷酸序列如序 列表中序列3的第7-40位所示、花药或雄蕊器官原基特异启动子的核苷酸序列如序列表中 序列1所示、乙烯受体ETRl蛋白的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述重组表达载体的构建方法是将所述启动子和所述乙烯受体ETRl蛋白的编码基因的反向互补基因插入一中间载体 的多克...

【专利技术属性】
技术研发人员：白书农，李曦，王东辉，许智宏，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]