【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物快速检测，更具体地，涉及一种化脓链球菌mcda扩增引物组及其应用和mcda-lfb检测化脓链球菌中的方法。
技术介绍
1、化脓链球菌(streptococcus pyogenes，s.pyogenes)是一种β溶血的链球菌，广泛存在于自然界和人及动物粪便和健康人鼻咽部，引起各种化脓性炎症，猩红热，丹毒，新生儿败血症，脑膜炎，产褥热以及链球菌变态反应性疾病等。
2、目前对于化脓链球菌的检测主要依赖于传统的分离培养和生化鉴定。该方法耗时较长(2至7天)，包括二次增菌，选择培养及后续的生化鉴定，尽管生化鉴定可依靠全自动微生物鉴定仪进行结果判读，但该方法仍存在耗时耗力的缺点。随着分子诊断技术的快速发展，一些以pcr为基础的诊断技术(如普通pcr技术，荧光pcr技术)被用于化脓链球菌的快速检测，然而这些方法操作繁琐，需要昂贵的仪器设备和昂贵的探针合成，后续的电泳操作，以及熟练的操作人员。然而一些基层医院和现场检测无法满足上述条件，限制了这些技术的运用。
3、为了克服pcr扩增技术的劣势，实现便捷、快速、敏感及特异的扩增核酸序列。中国专利cn104946744a公开了一种新的核酸扩增技术，命名为多交叉置换扩增(multiplecross displacement amplification，mcda)。该技术较pcr技术而言，不依赖于热循环扩增设备，反应速度快，敏感性好。因此，mcda技术有利于实现快速扩增，便捷检测及现场诊断，为了给予临床病人准确快速的治疗，研发一个省时、省力和特异性较高的检测方
4、目前，还未见有采用mcda-lfb技术，针对化脓链球菌的特异性基因设计mcda扩增引物，并结合lfb技术展开特异性检测的研究。因此，有必要研发关用于扩增化脓链球菌的特异性基因的mcda扩增引物，进而结合lfb技术，以提供更灵敏、更客观、更易于携带、更简单的检测方法。
技术实现思路
1、本专利技术为了克服上述现有技术中存在的上述缺陷和不足，将mcda-lfb技术用于化脓链球菌的检测，针对化脓链球菌的特异基因speb设计一套mcda扩增引物组，并建立了化脓链球菌病原体的快速、敏感和特异的mcda-lfb检测体系。
2、本专利技术的第一个目的在于提供一种化脓链球菌mcda扩增引物组。
3、本专利技术的第二个目的在于提供所述化脓链球菌mcda扩增引物组的应用。
4、本专利技术的第三个目的在于提供一种检测化脓链球菌的方法。
5、本专利技术的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
6、一种化脓链球菌mcda扩增引物组，包括：一对置换引物f1和f2，其序列依次如seqid no.1～2所示；一对交叉引物cp1和cp2，其序列依次如seq id no.3～4所示；6条扩增引物c1、c2、d1、d2、r1和r2，其序列依次如seq id no.5～10所示，其中，扩增引物d1的5’端标记荧光素即得到d1*，扩增引物r1的5’端标记生物素即得到r1*。
7、本专利技术针对化脓链球菌的特异基因speb设计若干mcda扩增引物，通过性的筛选获得上述敏感性，特异性及可靠性好的一套mcda扩增引物组，包括f1、f2、cp1、cp2、c1、c2、d1、d2、r1、r2；为了构建后续lfb可视化检测产物，在引物d1的5’端标记荧光素命名为d1*，在引物r1的5’端标记生物素命名为r1*；交叉引物cp1和cp2是介导mcda扩增的主要引物；置换引物f1和f2置换在mcda反应中发挥置换作用，置换交叉引物cp1和cp2；六条扩增引物d1*，c1，r1*，d2，c2和r2能够加速mcda反应及增加mcda产物量。
8、本专利技术还提供上述化脓链球菌mcda扩增引物组在化脓链球菌检测或在制备化脓链球菌检测试剂盒中的应用。例如可将所述mcda扩增引物扩增得到的mcda产物可结合可视颜色变化法、电泳检测法或lfb检测等用于化脓链球菌的检测。优选地，是将mcda产物结合lfb用于化脓链球菌的检测。
9、进一步地，所述检测为采用mcda-lfb技术检测。所述lfb，即金纳米生物传感器包括样品垫，金标垫，纤维膜，吸水垫及背板；所述样品垫，金标垫，纤维膜及吸水垫依次组装在背板上；将金纳米粒子偶联的链霉素亲和素包被在金标垫上包被上，抗荧光素抗体包被在检测线上，生物素偶联的牛血清蛋白包被在控制线上。其检测原理是：将mcda产物直接滴加到lfb的样品垫区域，然后将检测缓冲液加到样品垫区域，mcda产物在虹吸作用下，从下往上运动(从样品垫向吸水垫方向运动)。当mcda产物达到金标垫后，双标产物的一端(即生物素标记端)与sa-g(金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)反应。当产物继续运动，双标产物的另一端(即荧光素标记端)与检测线区域的抗体结合，将双标产物固定在检测线(tl)区域。随着产物在检测线区域的积累，通过另一端的sa-g(金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)进行显色反应，从而对mcda产物进行可视化检测。此外，过剩的sa-g(金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)可与cl(质控线)区域的b-bsa(金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)，进行直接显色反应，判断lfb的功能是否正常。
10、本专利技术还提供一种非疾病诊断治疗目的检测化脓链球菌的方法，包括如下步骤：
11、s1.提取待测样品基因组dna；
12、s2.以步骤s1待测样品基因组dna模板，采用上述任一所述化脓链球菌mcda扩增引物组进行mcda恒温扩增，得到扩增产物；
13、s3.使用金纳米生物传感器(lfb)检测步骤s2的扩增产物，根据显色反应，获得检测结果。
14、进一步地，步骤s2中所述mcda恒温扩增反应的温度为60～66℃。
15、进一步地，步骤s2中所述mcda恒温扩增反应恒温本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种化脓链球菌MCDA扩增引物组，其特征在于，包括：一对置换引物F1和F2，其序列依次如SEQ ID No.1～2所示；一对交叉引物CP1和CP2，其序列依次如SEQ ID No.3～4所示；6条扩增引物C1、C2、D1、D2、R1和R2，其序列依次如SEQ ID No.5～10所示，其中，扩增引物D1的5’端标记荧光素，扩增引物R1的5’端标记生物素。
2.权利要求1所述化脓链球菌MCDA扩增引物组在化脓链球菌检测或在制备化脓链球菌检测试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述检测为采用MCDA-LFB技术检测。
4.一种非疾病诊断治疗目的检测化脓链球菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤S2中所述MCDA恒温扩增反应的温度为60～66℃。
6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤S2中所述MCDA恒温扩增反应恒温程序为63℃30min，85℃5min终止反应。
7.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤S2中所述MCDA恒温扩增反应
8.一种化脓链球菌检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述化脓链球菌MCDA扩增引物组。
9.根据权利要求8所述检测试剂盒，其特征在于，还包括金纳米生物传感器。
10.根据权利要求9所述检测试剂盒，其特征在于，所述金纳米生物传感器包括样品垫，金标垫，纤维膜，吸水垫及背板；所述样品垫，金标垫，纤维膜及吸水垫依次组装在背板上；将金纳米粒子偶联的链霉素亲和素包被在金标垫上包被上，抗荧光素抗体包被在检测线上，生物素偶联的牛血清蛋白包被在控制线上。
...【技术特征摘要】
1.一种化脓链球菌mcda扩增引物组，其特征在于，包括：一对置换引物f1和f2，其序列依次如seq id no.1～2所示；一对交叉引物cp1和cp2，其序列依次如seq id no.3～4所示；6条扩增引物c1、c2、d1、d2、r1和r2，其序列依次如seq id no.5～10所示，其中，扩增引物d1的5’端标记荧光素，扩增引物r1的5’端标记生物素。
2.权利要求1所述化脓链球菌mcda扩增引物组在化脓链球菌检测或在制备化脓链球菌检测试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述检测为采用mcda-lfb技术检测。
4.一种非疾病诊断治疗目的检测化脓链球菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤s2中所述mcda恒温扩增反应的温度为60～66℃。
6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤s2中所述mcda恒温扩增反应恒温程序为63℃30min，85℃5min终止...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘得玺，窦志茜，蹇梦婵，路莹，孙宇阳，毕代蓉，毛敏，王锦星，刘毅力，郭冲，陈永吉，夏凌云，
申请(专利权)人：十堰市太和医院湖北医药学院附属医院，
类型：发明
国别省市：
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