【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程，尤其涉及一种不依赖β-丙氨酸添加的高产d-泛酸基因工程菌、构建方法及应用。
技术介绍
1、在自然界中，泛酸主要存在两种构型：d-泛酸和l-泛酸。在生物体内只有d-泛酸具有生物活性。d-泛酸(d-pantothenicacid)又称维生素b5，属于维生素b族水溶性维生素，广泛存在于多种食物中，是人体必需的13种维生素之一。d-泛酸在生物体内可作为辅酶a(coa)的前体，在几乎所有的生物过程中均发挥着关键作用，推动生物体内的能源代谢和能量交换。泛酸的磷酸化产物巯基乙胺可以合成4-磷酸泛酰巯基乙胺，为辅酶a(coa)及酰基载体蛋白(acp)的组成部分，而coa及acp作为构成酰基转移酶的辅酶，广泛参与糖、脂类、蛋白质代谢及肝脏的生物转化作用，对生物体的生长能够起到显著的促进作用。广泛应用于：食品、医药、饲料、化妆品等领域。
2、在已知的d-泛酸合成方法中，生物发酵法具有底物廉价、毒性小等优势而受到关注。但目前利用生物法生产d-泛酸仍存在缺陷，例如发酵需要添加大量的β-丙氨酸问题，这限制了泛酸细胞工厂的发展。前期的菌种构建工作中为了实现碳代谢向d-泛酸代谢途径的集中，进行了d-泛酸代谢途径改造，忽视了β-丙氨酸代谢途径。因此，在不需要外源添加β-丙氨酸时也能更高产的d-泛酸菌株的构建仍是一大挑战。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种不依赖β-丙氨酸添加的高产d-泛酸基因工程菌、构建方法，并将其应用于发酵生产d-泛酸，
2、为实现上述目的，本专利技术通过以下技术方案实现：
3、第一方面，本专利技术提供了一种不依赖β-丙氨酸添加的高产d-泛酸基因工程菌，由如下方法构建获得：
4、以菌株e.coliw3110trc-panc/trc-pane/trc-panb/trc-ilvc/ilvg*/δavta/ilve*/coaa*/ilva*/trc-lpd/δglk为底盘菌株，将来源于谷氨酸棒状杆菌的panb基因整合至其基因组中的假基因ycjv位点，并将来源于枯草芽孢杆菌的pand基因，来源于谷氨酸棒状杆菌的aspb基因和pyc基因在底盘菌中过表达，从而获得所述高产d-泛酸基因工程菌。
5、本专利技术在底盘菌e.coli w3110 trc-panc/trc-pane/trc-panb/trc-ilvc/ilvg*/δavta/ilve*/coaa*/ilva*/trc-lpd/δglk的基础上，综合运用系统代谢工程策略，借助调节元件来优化大肠杆菌生物体内泛解酸合成途径、β-丙氨酸合成途径、泛解酸和β-丙氨酸缩合途径中关键基因的表达水平，进一步使碳通量流向泛解酸和β-丙氨酸达到平衡，增加d-泛酸的合成，最终得到一株不添加β-丙氨酸高产d-泛酸的工程菌株，具体为：
6、(1)以实验室保藏菌株dpa11a(e.coliw3110 trc-panc/trc-pane/trc-panb/trc-ilvc/ilvg*/δavta/ilve*/coaa*/ilva*/trc-lpd/δglk)为底盘菌株(该菌株已在专利cn113637618a中公开)，在泛解酸合成分支途径上，将来源于枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)的alss基因、来源于谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)的panb和来源于大肠杆菌(escherichia coli)的pane、ilvc、ilvd基因构建到ptrc99a质粒(kan抗性)上，得到ptrc99a/alss、ptrc99a/panb、ptrc99a/pane、ptrc99a/ilvc、ptrc99a/ilvd，分别导入到dpa11a底盘菌株中获得产d-泛酸的基因工程菌，记为zpa1-5；
7、(2)同样地，以dpa11a为底盘菌株，在β-丙氨酸分支途径上，将来源于e.coli的aspc、aspa基因、来源于b.subtilis的pand基因和来源于c.glutamicum的aspb、pyc基因构建到ptrc99a质粒上，得到ptrc99a/aspc、ptrc99a/aspa、ptrc99a/pand、ptrc99a/aspb、ptrc99a/pyc，分别导入到dpa11a底盘菌株中获得产d-泛酸的基因工程菌，记为zpa6-10；
8、(3)同样地，以dpa11a为底盘菌株，在泛解酸和β-丙氨酸缩合途径上，将来源于c.glutamicum的panc基因构建到ptrc99a质粒上，得到ptrc99a/panc，导入到dpa11a底盘菌株中获得产d-泛酸的基因工程菌，记为zpa11；
9、(4)将步骤(1)和(2)构建好的菌株中，在摇瓶中进行发酵，各筛选出较优的2-3个关键酶基因(优选的，泛解酸合成分支途径选择alss基因和panb基因，β-丙氨酸分支途径选择pand基因、aspb基因、pyc基因)，将其进行串联构建到ptrc99a质粒上，得到ptrc99a/alss-panb、ptrc99a/pand-aspb-pyc，分别导入dpa11a底盘菌株中获得产d-泛酸的基因工程菌，记为zpa12-13；
10、(5)将步骤(3)和(4)构建好的质粒进一步串联，构建到ptrc99a质粒上，得到ptrc99a/alpb-dabp-c，导入dpa11a底盘菌中获得产d-泛酸的基因工程菌，记为zpa14；
11、(6)以工程菌dpa11a为出发菌株，运用crispr-cas9介导的基因编辑技术，将受来源于ptrc99a的ptrc启动子调控的alss基因替换掉出发菌株基因组上原有假基因yjip，增强alss的表达强度，得到工程菌dpa11aderivative，yjip::ptrc-alss，记为工程菌zpa15；
12、(7)以工程菌zpa15为出发菌株，运用crispr-cas9介导的基因编辑技术，将受来源于ptrc99a的ptrc启动子调控的panb基因替换掉出发菌株基因组上原有假基因ycjv，进一步增强panb的表达强度，得到工程菌zpa15 derivative，ycjv::ptrc-panb，记为工程菌zpa16；(8)将质粒ptrc99a/pand-aspb-pyc分别导入zpa15、zpa16底盘菌株中获得产d-泛酸的基因工程菌，记为zpa17、zpa18。
13、受ptrc启动子调控的alss基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；panb基因的核苷酸序列如seq id no.2所示；pane基因的核苷酸序列如seq id no.3所示；ilvc基因的核苷酸序列如seq id no.4所示；ilvd基因的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述aspc基因的核苷酸序列如seq id no.6所示；aspa基因的核苷酸序列如seq id no.7所示；pand基因本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种不依赖β-丙氨酸添加的高产D-泛酸基因工程菌，其特征在于，由如下方法构建获得：以菌株E.coli W3110 Trc-panC/Trc-panE/Trc-panB/Trc-ilvC/ilvG*/△avtA/ilvE*/coaA*/ilvA*/Trc-lpd/△glk为底盘菌株，将来源于谷氨酸棒状杆菌的panB基因整合至其基因组中的假基因ycjV位点，并将来源于枯草芽孢杆菌的panD基因，来源于谷氨酸棒状杆菌的aspB基因和pyc基因在底盘菌中过表达，从而获得所述高产D-泛酸基因工程菌。
2.如权利要求1所述的高产D-泛酸基因工程菌，其特征在于，所述panB基因受Ptrc启动子调控，所述panB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.如权利要求1或2所述的高产D-泛酸基因工程菌，其特征在于，所述panD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
4.如权利要求3所述的高产D-泛酸基因工程菌，其特征在于，所述aspB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述pyc基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。>
5.一种用于构建如权利要求1～4中任意一项所述的高产D-泛酸基因工程菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.权利要求1～4中任意一项所述的高产D-泛酸基因工程菌或者权利要求5所述方法所构建的高产D-泛酸基因工程菌在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用包括：将所述基因工程菌接种至发酵培养基中，在28～30℃、pH6.6～6.8条件下发酵培养，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到D-泛酸。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基组成包括：葡萄糖10～20g/L、(NH4)2SO412～16g/L、KH2PO41～2g/L、MgSO40.3～0.5g/L、酵母提取物1～2g/L、β-丙氨酸0.1～0.5g/L、微量金属离子溶液0.5～1ml/L、Kan抗生素50～75mg/L、IPTG0.1～0.2mM，溶剂为去离子水，pH值自然。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述微量金属离子溶液组成包括：5～10g/LCoCl2、5～10g/L FeSO4·7H2O、0.5～1g/L ZnSO4·7H2O、0.10～0.20g/L CuSO4、0.01～0.02g/LNiCl2·7H2O，溶剂为去离子水。
10.如权利要求7或8所述的应用，其特征在于，发酵起始时使用发酵培养基，并依据20％溶氧反馈补料策略，将补料培养基补加至发酵系统，补料培养基组成包括：葡萄糖400～500g/L，硫酸铵8～10g/L，酵母提取物1～3g/L，磷酸二氢钾10～14g/L，无水硫酸镁6～8g/L，甜菜碱2～4g/L，VBl 0.01g/L，VB120.004 g/L，异亮氨酸100～160m g/L，盐溶液1～2mL/L，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷94～98mg/L，硫酸卡那霉素80～100mg/L。
...【技术特征摘要】
1.一种不依赖β-丙氨酸添加的高产d-泛酸基因工程菌，其特征在于，由如下方法构建获得：以菌株e.coli w3110 trc-panc/trc-pane/trc-panb/trc-ilvc/ilvg*/△avta/ilve*/coaa*/ilva*/trc-lpd/△glk为底盘菌株，将来源于谷氨酸棒状杆菌的panb基因整合至其基因组中的假基因ycjv位点，并将来源于枯草芽孢杆菌的pand基因，来源于谷氨酸棒状杆菌的aspb基因和pyc基因在底盘菌中过表达，从而获得所述高产d-泛酸基因工程菌。
2.如权利要求1所述的高产d-泛酸基因工程菌，其特征在于，所述panb基因受ptrc启动子调控，所述panb基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
3.如权利要求1或2所述的高产d-泛酸基因工程菌，其特征在于，所述pand基因的核苷酸序列如seq id no.8所示。
4.如权利要求3所述的高产d-泛酸基因工程菌，其特征在于，所述aspb基因的核苷酸序列如seq id no.9所示，所述pyc基因的核苷酸序列如seq id no.10所示。
5.一种用于构建如权利要求1～4中任意一项所述的高产d-泛酸基因工程菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.权利要求1～4中任意一项所述的高产d-泛酸基因工程菌或者权利要求5所述方法所构建的高产d-泛酸基因工程菌在微生物发酵制备d-泛酸中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：邹树平，朱鑫涛，柳志强，张博，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
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