【技术实现步骤摘要】
本公开属于生物医药领域，具体涉及一种t细胞抗原受体及其制备方法和应用。
技术介绍
1、t细胞受体(t cell receptor,tcr)是t淋巴细胞特异性识别抗原、启动免疫应答的分子，为免疫球蛋白超家族的异二聚体细胞表面蛋白，其与参与调节信号转导的cd3复合物的无变异蛋白相关联。tcr是呈递在主要组织相容性复合体(mhc)上的特异性抗原肽的唯一受体，对免疫系统的细胞免疫功能至关重要，抗原特异性tcr与mhc复合物结合引发t细胞与抗原呈递细胞直接的物理接触，相互作用，导致一系列后续细胞信号传递和其他生理反应，从而使得不同抗原特异性的t细胞对其靶细胞发挥免疫效应。
2、巨细胞病毒(cytomegalovirus，cmv)是一种疱疹病毒组dna病毒，由于被感染的细胞会发生肿大，因此被命名为巨细胞病毒。cmv是人类最常见病原体之一，在人群中广泛流行，其在成人群体中的感染率可以高达50％-100％。在免疫系统正常的个体中，cmv的感染后通常不会出现任何临床症状，但是在无症状原发感染后，cmv病毒常常不能被完全清除，而在患者体内形成持续性地潜伏感染。如果携带cmv的个体免疫系统的功能被抑制，如艾滋病发病、器官移植后接受免疫抑制治疗，潜伏的cmv感染再度活化可导致严重甚至致死性疾病。此外cmv的感染还可能与部分肿瘤的发病和进展有关。例如，一半的胶质细胞瘤组织中，可以检测到cmv-pp65抗原，因此，预防和治疗与cmv感染相关的疾病也成为药物开发的方向之一。
3、目前，开发了利用cmv特异性tcr制备tcr-t细胞针对
4、cn113881680a和cn102656188a均公开了能够识别巨细胞病毒的抗原的tcr，但其筛选方式没有特别关注tcr识别的异质性，对靶细胞的杀伤作用不明显。cn106279404a公开了一种可溶且稳定的异质二聚tcr，其在α链可变区与β链恒定区之间含有人工链间二硫键的异质二聚tcr，该tcr可溶且稳定，能够被很好地复性、重折叠、纯化同时能够与原配体特异性结合。但该专利未公开针对巨细胞病毒的特异性tcr。
技术实现思路
1、tcr-t疗法能够有效的控制急性cmv疾病，引起抗病毒免疫应答；但如何从病人体内或者体外刺激的细胞毒t淋巴细胞中获得有效的t细胞，快速的获得其tcr序列，从而构建有功能的tcr转导的特异性t细胞，是tcr-t应用的阻碍。本公开在单细胞测序技术的基础上，通过高通量测序实现tcr配对序列的测定，并通过免疫细胞对重要基因表达水平进行评估，进行特异性t细胞受体研究。具体的，本公开的一种实现方式中，基于hla-a*2402分型的cmv pp65341-349短肽抗原qydpvaalf体外诱导扩增抗原特异性的细胞毒t淋巴细胞，通过单细胞测序、mhc四聚体分选后阳性的t细胞的tcr配对信息，按照克隆序列频率筛选tcr，构建tcr-t，并进行体外的功能验证，评估tcr-t的功能，最终研发获得本公开的特异性t细胞受体。
2、本公开所述hla-a24-cmv-pp65341-349抗原复合物由人白细胞表面抗原hla-a24及cmv-pp65341-349短肽(天然序列：qydpvaalf(seq id no：13))组成，表达于目标靶细胞表面。
3、为实现上述目的，本公开的第一方面，提供一种识别人巨细胞病毒pp65抗原的tcr，所述tcr具有结合hla-a24-cmv-pp65341-349抗原复合物的特性，所述tcr至少包含一个α链可变区和/或β链可变区。优选的，所述的t细胞抗原受体是αβ异二聚体，且各自包含一个tcrα链可变区和一个tcrβ链可变区。
4、在其中一个实施方式中，所述tcrα链可变区包含cdr1α-cdr3α三个互补决定区(cdr)，其中cdr3α包含seq id no：3、seq id no：22、seq id no：31之一所示的序列，或包含与seq id no：3、seq id no：22、seq id no：31之一具有至少85％、90％、95％、98％或至少99％以上同源性的氨基酸序列。优选地，所述tcrα链可变区的cdr3的氨基酸序列如seq idno：3、seq id no：22、seq id no：31之一所示。
5、在其中一个实施方式中，tcrβ链可变区包含cdr1β-cdr3β三个cdr区，其中cdr3β包含seq id no：6所示的序列，或包含与seq id no：6、seq id no：16、seq id no：25之一具有至少85％、90％、95％、98％或至少99％以上同源性的氨基酸序列；优选地，所述tcrβ链可变区的cdr3β的氨基酸序列如seq id no：6、seq id no：16、seq id no：25之一所示。
6、在其中一个实施方式中，所述tcrα链可变区的cdr1α包含seq id no：1所示的氨基酸序列，或包含与seq id no：1具有至少85％、90％、95％、98％或至少99％以上同源性的氨基酸序列；cdr2α包含seq id no：2所示的氨基酸序列，或包含与seq id no：2具有至少85％、90％、95％、98％或至少99％以上同源性的氨基酸序列；所述tcrβ链可变区的cdr1β包含seq id no：4、seq id no：14、seq id no：23之一所示的氨基酸序列，或包含与seq idno：4、seq id no：14、seq id no：23具有至少85％、90％、95％、98％或至少99％以上同源性的氨基酸序列；cdr2β包含seq id no：5、seq id no：15、seq id no：24之一所示的氨基酸序列，或包含与seq id no：5、seq id no：15、seq id no：24之一具有至少85％、90％、95％、98％或至少99％同源性的氨基酸序列。
7、在优选地实施方式中，所述tcr的cdr1α-cdr3α和β链的cdr1β-cdr3β的氨基酸序列如下所示：
8、cdr1α：ssnfya(seq id no：1)；
9、cdr2α：mtlngde(seq id no：2)；
10、cdr3α：carntgklif(seq id no：3)、capsaskiif(seq id no：22)、capqfnkfyf(seqid no：31)之一；
11、cdr1β：sqvtm(seq id no：4)、sghvs(seq id no：14)、lnhda(seq id n本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种T细胞抗原受体，其特征在于，所述的T细胞抗原受体特异性结合CMV pp65，其中，所述的T细胞抗原受体包含α链的CDR1α-CDR3α和/或β链的CDR1β-CDR3β，其中，CDR3α包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：31之一所示的氨基酸序列，或包含与SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：31之一具有至少85％以上同源性的氨基酸序列；和/或其中，CDR3β包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：25之一所示的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：25之一具有至少85％以上同源性的氨基酸序列，
2.根据权利要求1所述的T细胞抗原受体，其特征在于，所述的α链的CDR1α-CDR3α和β链的CDR1β-CDR3β的氨基酸序列如下所示：
3.根据权利要求1-2任一所述的T细胞抗原受体，其α链的可变区包含SEQ ID NO：7、SEQID NO：17、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：32所
4.根据权利要求1-3任一所述的T细胞抗原受体，其特征在于，其α链与β链的氨基酸直接连接或间接连接，优选为间接连接，更优选通过fp2A连接，优选地，所述fp2A的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示；
5.一种编码权利要求1-4任一所述的T细胞抗原受体的核酸。
6.一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体包含权利要求5所述的核酸。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包含权利要求5所述的核酸或权利要求6所述的表达载体。
8.一种免疫细胞，其特征在于，所述的免疫细胞表达权利要求1-4任一所述的T细胞抗原受体。
9.一种免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括将编码权利要求5所述的核酸序列转导至免疫细胞中表达获得。
10.一种重组T细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
11.一种T细胞抗原受体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
12.权利要求1-4任一所述的T细胞抗原受体、权利要求5所述的核酸、权利要求6所述的表达载体、权利要求7所述的宿主细胞、权利要求8任一所述的免疫细胞在制备诊断、预防或治疗与CMV相关疾病的产品中的应用，或在T细胞标记、检测、细胞分选或活化中的应用。
13.一种药物组合物，所述的药物组合物包含下列任一组：
14.一种试剂盒，所述的试剂盒包含下列任一组：
...【技术特征摘要】
1.一种t细胞抗原受体，其特征在于，所述的t细胞抗原受体特异性结合cmv pp65，其中，所述的t细胞抗原受体包含α链的cdr1α-cdr3α和/或β链的cdr1β-cdr3β，其中，cdr3α包含seq id no：3、seq id no：22、seq id no：31之一所示的氨基酸序列，或包含与seq idno：3、seq id no：22、seq id no：31之一具有至少85％以上同源性的氨基酸序列；和/或其中，cdr3β包含seq id no：6、seq id no：16、seq id no：25之一所示的氨基酸序列，或包含与seq id no：6、seq id no：16、seq id no：25之一具有至少85％以上同源性的氨基酸序列，
2.根据权利要求1所述的t细胞抗原受体，其特征在于，所述的α链的cdr1α-cdr3α和β链的cdr1β-cdr3β的氨基酸序列如下所示：
3.根据权利要求1-2任一所述的t细胞抗原受体，其α链的可变区包含seq id no：7、seqid no：17、seq id no：26、seq id no：32所示的氨基酸序列或包含与seq id no：7具有至少85％以上同源性的氨基酸序列；
4.根据权利要求1-3任一所述的t细胞抗原受体，其特征在于，其α链与β链的...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙娇钧，徐其龙，李雪姣，李晓丹，王歈，
申请(专利权)人：北京永泰瑞科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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