【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及兽医领域，具体涉及一种表达绵羊痘病毒p32基因的重组羊口疮病毒的制备方法及应用。
技术介绍
1、“羊口疮(orf)”又称羊传染性脓疱皮炎(contagious ecthyma,ce)，是由羊口疮病毒(orf virus,orfv)引起的一种接触性、嗜上皮性传染病。cev不仅感染绵羊、山羊、鹿以及其他小反刍动物，而且可以感染人类，是一种人兽共患病。该病病死率低，但发病率高，分布广泛，几乎全世界的养羊地区均有该病的报道，给全球养羊业造成巨大的损失。羊传染性脓疱皮炎流行范围很广，其对世界畜牧业的危害巨大。目前尚无有效的特异性药物用于羊口疮的治疗。
2、绵羊痘是由绵羊痘病毒(sheep pox virus,sppv)引起的羊的一种急性、热性、接触性传染病。受到该病毒感染的羊，一般会在鼻子、眼睛、尾根和乳房等部位出现痘疹。羊群皮毛质量下降，或造成羔羊的大批死亡，是制约国际贸易和养羊业健康发展的主要疾病。世界动物卫生组织(oie)将其列为“法定通报疾病”，我国将该病列为一类动物疾病。
3、目前，疫苗接种仍是羊口疮和绵羊痘防控的重要手段，但常规的灭活疫苗和弱毒疫苗免疫效果不理想。灭活疫苗制作比较简单，但是存在着免疫保护时间短、所需剂量大、免疫效果不佳等缺点，因此大部分灭活疫苗需要与佐剂搭配使用。弱毒活疫苗是强毒株经过人工传代培养致弱，或者从自然界分离的弱毒株制成的活疫苗，缺点是弱毒株易毒力返强，对一些极易感动物存在一定的危险性，其免疫效果易受多种因素的影响，并且对运输和保存有一定的要求。因此急需开展对羊口
4、随着dna重组技术、反向遗传操作、基因编辑等技术的蓬勃发展，基因工程疫苗逐渐成为研究的热点，其中重组活载体疫苗也越来越引发人们的关注。目前用于研制病毒活载体疫苗研究所涉及到的病毒疫苗的载体主要包括痘病毒、疱疹病毒以及腺病毒等。羊口疮病毒属痘病毒科(poxviridae)、副痘病毒属，有研究表明，orfv作为病毒载体有如下的优势：①有限的宿主范围；②具有较好的免疫刺激能力；③具有自限性，orfv是一种嗜上皮病毒，引起的损伤不会造成病毒感染的全身化；④免疫后不产生中和性的血清抗体，可以多次重复免疫；⑤基因组较大，适合携带大片段外源基因。这些优势使得orfv可以作为基因工程疫苗的载体。
5、绵羊痘p32基因大小为972bp，可编码大小为32kd蛋白，p32蛋白是羊痘病毒属特有的蛋白，含有主要的抗原表位,在病毒感染早期产生抗体。该蛋白早已应用于elisa法来检测羊和牛血清中的羊痘抗体，p32基因也是诊断试剂和疫苗研究的热门靶点。
技术实现思路
1、为了克服现有技术的缺陷，本专利技术提供了一种表达绵羊痘病毒p32基因(sppvp32)的重组羊口疮病毒，所述羊口疮病毒为毒力基因缺失的减毒株，所述羊口疮病毒为orfs 119-125基因缺失株，所述p32基因的表达产物如seq id no.15所示。
2、优选的，所述羊口疮病毒表达seq id no.2所示的绵羊痘病毒p32基因。
3、将羊口疮病毒orfv 119基因、orfv 120基因、orfv 121基因、orfv 122基因、orfv123基因、orfv 124基因、orfv 125基因及其之间间隔的基因全部删除，获得orfv-sy17△orfs119-125-egfp缺失株，再敲除egfp基因、重组绵羊痘病毒p32基因，获得所述表达绵羊痘病毒p32基因的重组羊口疮病毒，将此重组毒株命名为orfv-sy17△orfs119-125/p32。
4、优选的是，所述的羊口疮病毒为orfv-sy17。
5、所述的羊口疮病毒orfv-sy17分离株，该毒株全基因组序列已于genbank公开(genbank序列号：mg712417.1)，并且orfv-sy17已在现有技术中公开，公众可通过与作者共享的方式获得；绵羊痘病毒(sheep pox virus，sppv)，其全长序列参见genbank：ay077834.1，绵羊痘p32基因核苷酸序列如seq id no.2所示。绵羊痘病毒分离株为已报道病毒，公众可通过与作者共享的方式获得其毒株。优选的是，orfv-sy17orfs 119-125基因缺失为orfv-sy17分离株全长序列的119691至127159位核苷酸的缺失，插入的绵羊痘病毒p32基因(简称绵羊痘p32基因，sppv p32)片段中的第1至972位核苷酸。
6、上述任一项优选的是，缺失的orfv-sy17 orfs 119-125基因序列为如seq idno.1所示的核苷酸序列。
7、上述任一项优选的是，敲除所述羊口疮病毒seq id no.1所示的核苷酸获得orfs119-125缺失株，再将绵羊痘病毒p32基因插入到orfs 119-125缺失位置，获得所述表达绵羊痘病毒p32基因的重组羊口疮病毒。
8、上述任一项优选的是，所述绵羊痘病毒p32基因为seq id no.2所示的核苷酸序列。
9、上述任一项优选的是，所述绵羊痘病毒p32基因为seq id no.2所示的核苷酸序列经过密码子优化获得的能够表达seq id no.15所示的氨基酸序列的核苷酸序列，例如，如seq id no.16所示的核苷酸序列。
10、本专利技术还提供了上述任一项所述表达绵羊痘病毒p32基因的重组羊口疮病毒的制备方法。
11、优选的是，所述表达绵羊痘病毒p32基因的重组羊口疮病毒的重组毒株按照一些方法制备：先将羊口疮病毒orfs 119-125基因缺失，获得orfv-sy17△orfs 119-125-egfp缺失株，之后在其位置插入绵羊痘病毒p32基因，获得所述表达绵羊痘病毒p32基因的重组羊口疮病毒，即orfv-sy17△orfs119-125/p32重组毒株。
12、优选的是，所述制备方法包括以下步骤：
13、步骤1：重组质粒的构建：包括重组质粒puc57-lfδorf119-egfp-rfδorf125和重组质粒puc57-lfδorf119-p32-rfδorf125。
14、步骤2：orfv-sy17△orfs 119-125-egfp缺失毒株的构建、筛选、纯化；
15、步骤3：orfv-sy17△orfs 119-125-egfp缺失毒株的生物学特性分析；
16、步骤4：orfv-sy17△orfs119-125/p32重组毒株的构建、筛选、纯化；
17、步骤5：orfv-sy17△orfs119-125/p32重组毒株的生物学特性分析。
18、优选的是，所述制备方法包括以下步骤：
19、步骤1：重组载体的构建：分别扩增orfv-sy17株的orfv119基因上游和orfv125基因下游的序列作为左右重组同源臂，克隆至筛选表达盒puc57-vv7.5-egf本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种表达绵羊痘病毒P32基因的重组羊口疮病毒，所述羊口疮病毒为毒力基因缺失的减毒株，其特征在于，所述羊口疮病毒为ORFs 119-125基因缺失株，所述P32基因的表达产物如SEQ ID NO.15所示。
2.如权利要求1所述的表达绵羊痘病毒P32基因的重组羊口疮病毒，其特征在于，所述的羊口疮病毒为ORFV-SY17。
3.如权利要求2所述的表达绵羊痘病毒P32基因的重组羊口疮病毒，其特征在于，缺失的ORFV-SY17 ORFs119-125基因序列为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
4.如权利要求3所述的表达绵羊痘病毒P32基因的重组羊口疮病毒，其特征在于，敲除所述羊口疮病毒SEQ ID NO.1所示的核苷酸片段获得ORFs 119-125缺失株，再将绵羊痘病毒P32基因插入到ORFs119-125缺失位置，获得所述表达绵羊痘病毒P32基因的重组羊口疮病毒。
5.如权利要求4所述的表达绵羊痘病毒P32基因的重组羊口疮病毒，其特征在于，所述绵羊痘病毒P32基因为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
6.
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：重组载体的构建：分别扩增ORFV-SY17株的ORFV119基因上游和ORFV125基因下游的序列作为左右重组同源臂，克隆至筛选表达盒pUC57-vv7.5-eGFP上，获得携带标记基因eGFP的pUC57-LFΔORF119-eGFP-RFΔORF125重组质粒；步骤2：构建表达绵羊痘病毒P32基因的重组载体：所述重组载体用绵羊痘P32基因替换步骤1中的pUC57-LFΔORF119-eGFP-RFΔORF125重组质粒中的eGFP基因，获得表达绵羊痘病毒P32基因的pUC57-LFΔORF119-P32-RFΔORF125重组质粒；步骤3：利用步骤1制备的pUC57-LFΔORF 119-eGFP-RFΔORF125重组质粒转染已感染ORFV-SY17野毒株的OFTu细胞，通过荧光斑法和有限稀释法获得表达绿色荧光蛋白的ORFV-SY17ΔORFs 119-125-eGFP缺失毒株；步骤4：利用步骤2制备的pUC57-LFΔORF119-P32-RFΔORF125重组质粒转染已感染ORFV-SY17ΔORFs 119-125-eGFP的OFTu细胞，敲除eGFP，制备得到表达绵羊痘病毒P32基因的重组羊口疮病毒。
8.权利要求1-5任一项所述的表达绵羊痘病毒P32基因的重组羊口疮病毒或权利要求6或7所述的方法在制备绵羊痘病毒疫苗中的应用。
9.权利要求1-5任一项所述的表达绵羊痘病毒P32基因的重组羊口疮病毒或权利要求6或7所述的方法在制备绵羊痘病毒-羊口疮病毒二联疫苗中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种表达绵羊痘病毒p32基因的重组羊口疮病毒，所述羊口疮病毒为毒力基因缺失的减毒株，其特征在于，所述羊口疮病毒为orfs 119-125基因缺失株，所述p32基因的表达产物如seq id no.15所示。
2.如权利要求1所述的表达绵羊痘病毒p32基因的重组羊口疮病毒，其特征在于，所述的羊口疮病毒为orfv-sy17。
3.如权利要求2所述的表达绵羊痘病毒p32基因的重组羊口疮病毒，其特征在于，缺失的orfv-sy17 orfs119-125基因序列为如seq id no.1所示的核苷酸序列。
4.如权利要求3所述的表达绵羊痘病毒p32基因的重组羊口疮病毒，其特征在于，敲除所述羊口疮病毒seq id no.1所示的核苷酸片段获得orfs 119-125缺失株，再将绵羊痘病毒p32基因插入到orfs119-125缺失位置，获得所述表达绵羊痘病毒p32基因的重组羊口疮病毒。
5.如权利要求4所述的表达绵羊痘病毒p32基因的重组羊口疮病毒，其特征在于，所述绵羊痘病毒p32基因为seq id no.2所示的核苷酸序列。
6.权利要求1-5任一项所述表达绵羊痘病毒p32基因的重组羊口疮病毒的制备方法。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：重组载体的构建：分别扩增orfv-sy17株的orfv119基因上游和orfv125基因...
【专利技术属性】
技术研发人员：关继羽，杜乐，林静，赵魁，陆慧君，高丰，贺文琦，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：
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