【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种纳米抗体、包含该纳米抗体的多肽及其应用。
技术介绍
1、腺相关病毒(adeno-associated virus，aav)，属于微小病毒科依赖病毒属，具有二十面体结构，是目前发现的一类结构最简单的单链dna缺陷型病毒，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。该病毒颗粒的直径在20～26nm之间，含有大小在4.7～6kb之间的线状单链dna基因组。aav对人类不致病，研究表明，约80％人群aav血清检测阳性。
2、重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus，raav)源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。包括体内、体外实验的基因功能研究、构建疾病模型、基因敲除、基因治疗和疫苗研究等方面。
3、由于raav的上游生产是在细胞中完成的，因此其裂解产物中有核酸、培养基残留杂质、宿主细胞蛋白质等杂质，残留的dna可以用核酸酶处理，但hcp的去除是一个复杂的过程，通常多个步骤，而这些步骤可能降低收率，延迟工艺开发，给下游纯化工艺带来极大的挑战。尤其是aav有多种不同的血清型(aav1-aav10)，其具有不同的衣壳蛋白空间结构、序列和组织特异性，对不同组织和细胞具有不同的感染效率，识别与结合不同的细胞表面受体，因此，通用型的亲和层析方案很难实现。
4、传统的下游工艺需
5、为了解决这一挑战，最新的亲和层析法减少了纯化aav所需的步骤数，提高了收率并缩短了工艺时间。例如，肝素-亲和层析柱可用于纯化raav3和raav6；粘蛋白-亲和层析柱可用于纯化raav1、raav4、raav5和rvva6；抗体-亲和柱用于检测和纯化raav，如识别和结合aavxl32.1的单克隆抗体(专利文献1)、特异识别aav9衣壳蛋白的多克隆抗体(专利文献2)等。
6、然而，传统抗体制备成本高昂，抗体尺寸较大导致在载体上偶联量低等缺陷限制了其工业化应用。驼源纳米抗体具有高度特异性和稳定性，基于纳米抗体的avbsepharosetm(ge healthcaretm)填料和porostmcaptureselect aavx(thermo scientifictm)填料(非专利文献1)在柱层析过程中表现良好，使aav亲和层析柱的工业化应用成为可能。但不同筛选方式筛选出的不同序列的纳米抗体，其亲和力、稳定性、结合谱都有很大差异。
7、专利文献1：cn113583112b
8、专利文献2：cn114685651a
9、非专利文献1：orjanaterova,et.al,overcoming downstream purificationchallenges for viral vector manufacturing:enabling advancement of genetherapies in the clinic，cell gene therapy insights 2018；4(2),101-111.
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供具有特定结构的氨基酸序列的纳米抗体、包含该纳米抗体的多肽及其应用，以解决现有aav富集、纯化、检测等方面面临的抗体制备工艺复杂、成本高，以及抗体亲和力、稳定性、结合谱差的问题。
2、为达到以上技术目的，本申请采用的技术方案如下：
3、第一方面，本专利技术提供一种纳米抗体，所述纳米抗体氨基酸序列中的可变区包括互补决定区cdr和框架区fr，所述互补决定区cdr包括互补决定区cdr1、互补决定区cdr2和互补决定区cdr3，其中，
4、所述互补决定区cdr1为包括下述式(i)：
5、ser-gly-xaa11-xaa12-phe-xaa13-xaa14-asn-xaa15， (i)；
6、所述互补决定区cdr2为包括下述式(ii)：
7、xaa21-thr-xaa22-xaa23-gly-xaa24-thr， (ii)；
8、所述互补决定区cdr3为包括下述式(iii)：
9、his-val-asp-glu-val-arg-xaa31-ser-ser-trp-thr-thr-ser-asn-leu， (iii)；
10、其中，
11、xaa11独立地选自arg、ser、thr；和/或，
12、xaa12独立地选自ala、gly、his、ile、met、asn、arg、ser、thr；和/或，
13、xaa13独立地选自ile、arg、ser、thr、val；和/或，
14、xaa14独立地选自ala、ile、leu；和/或，
15、xaa15独立地选自ala、ile、leu、ser、thr、val；和/或，
16、xaa21独立地选自phe、ile、leu、val；和/或，
17、xaa22独立地选自pro、arg、ser；和/或，
18、xaa23独立地选自ala、asp、gly；和/或，
19、xaa24独立地选自asp、gly、asn、ser、thr、val；和/或，
20、xaa31独立地选自asp、glu、gln。
21、优选地，所述互补决定区cdr1中，
22、所述xaa11为arg，xaa12为ser，xaa13为ser，xaa14为ile，xaa15为thr；或，
23、所述xaa11为ser，xaa12为arg，xaa13为ser，xaa14为ile，xaa15为thr；或，
24、所述xaa11为arg，xaa12为his，xaa13为ser，xaa14为ile，xaa15为thr；或，
25、所述xaa11为arg，xaa12为ala，xaa13为ser，xaa14为ile，xaa15为thr；或，
26、所述xaa11为ser，xaa12为ile，xaa13为ser，xaa14为ile，xaa15为ser；或，
27、所述xaa11为ser，xaa12为arg，xaa13为ser，xaa14为ile，xaa15为ser；或，
28、所述xaa11为ser，xaa12为ile，xaa13为ser，xaa14为ile，xaa15为leu；或，
29、所述xaa11为ser，xaa12为thr，xaa13为ser，x本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体氨基酸序列中的可变区包括互补决定区CDR和框架区FR，所述互补决定区CDR包括互补决定区CDR1、互补决定区CDR2和互补决定区CDR3，其中，
2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述互补决定区CDR1中，
3.根据权利要求1或2所述的纳米抗体，其特征在于，所述互补决定区CDR2中，
4.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述框架区FR包括：框架区FR1、框架区FR2、框架区FR3和框架区FR4，框架区FR1、框架区FR2、框架区FR3和框架区FR4为同源性50％以上的氨基酸序列，优选为同源性70％以上的氨基酸序列，进一步优选为同源性95％以上的氨基酸序列；
5.根据权利要求1～4任一项所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列包括：SEQ ID No:10、SEQ ID No:11、SEQ ID No:12、SEQ ID No:13、SEQ ID No:14、SEQID No:15、SEQ ID No:16、SEQ ID No:17、SEQ ID No:20、
6.根据权利要求1～5所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体是人源化纳米抗体，优选地，所述人源化纳米抗体包括SEQ ID No:117、SEQ ID No:118、SEQ ID No:119、SEQ IDNo:120。
7.一种多肽，其特征在于，是通过在权利要求1～6任一项所述的纳米抗体N-端和/或C-端氨基酸改造获得。
8.根据权利要求7所述的一种多肽，其特征在于，所述纳米抗体N-端和/或C-端氨基酸改造的方式包括：
9.一种多肽，其特征在于，是通过权利要求1～6任一项所述的纳米抗体经多价合成获得。
10.根据权利要求9所述的一种多肽，其特征在于，所述多价合成包括二价、三价或四价合成；
11.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1～6任一项所述的纳米抗体或权利要求7～10任一项所述的多肽。
12.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求11所述的核酸的表达框。
13.一种宿主细胞，其特征在于，含有权利要求12所述的表达载体，其不为植物或植物细胞。
14.权利要求1～6任一项所述的纳米抗体和/或权利要求7～10任一项所述的多肽在免疫检测、富集和或纯化上的应用，所述免疫检测不直接应用于疾病的诊断或治疗。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述纳米抗体和/或所述多肽在制备病毒吸附剂、病毒纯化试剂盒、病毒检测试剂盒上的应用；优选地，所述病毒为AAV。
16.一种病毒吸附剂，其特征在于，包括载体基质和权利要求1～6任一项所述的纳米抗体和/或权利要求7～10任一项所述的多肽。
17.一种病毒纯化试剂盒，其特征在于，包括载体基质和权利要求1～6任一项所述的纳米抗体和/或权利要求7～10任一项所述的多肽。
18.一种病毒检测试剂盒，其特征在于，包括载体基质和权利要求1～6任一项所述的纳米抗体和/或权利要求7～10任一项所述的多肽。
19.一种基于非诊断目的的AAV检测方法，其特征在于，将权利要求1～6任一项所述的纳米抗体和/或权利要求7～10任一项所述的多肽通过HRP偶联，然后采用直接酶免疫吸附测定法或者夹心酶免疫吸附测定法检测。
...【技术特征摘要】
1.一种纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体氨基酸序列中的可变区包括互补决定区cdr和框架区fr，所述互补决定区cdr包括互补决定区cdr1、互补决定区cdr2和互补决定区cdr3，其中，
2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述互补决定区cdr1中，
3.根据权利要求1或2所述的纳米抗体，其特征在于，所述互补决定区cdr2中，
4.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述框架区fr包括：框架区fr1、框架区fr2、框架区fr3和框架区fr4，框架区fr1、框架区fr2、框架区fr3和框架区fr4为同源性50％以上的氨基酸序列，优选为同源性70％以上的氨基酸序列，进一步优选为同源性95％以上的氨基酸序列；
5.根据权利要求1～4任一项所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列包括：seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seqid no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:20、seq id no:24、seq id no:25、seqid no:26、seq id no:27、seq id no:32、seq id no:33、seq idno:34、seq id no:35、seqid no:36、seq id no:42、seq id no:43、seq id no:44、seq id no:45、seq id no:46、seqid no:47、seq id no:48、seq id no:49、seq idno:50、seq id no:51、seq id no:52、seqid no:53、seq id no:54、seq id no:55、seq id no:56、seq id no:57、seq id no:65、seqid no:66、seq id no:67、seq idno:68、seq id no:78、seq id no:89、seq id no:104。
6.根据权利要求1～5所述的纳米抗体，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：王雨萌，黄春东，李妲，陈复，
申请(专利权)人：康元医疗科技大连有限公司，
类型：发明
国别省市：
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