一种人多能干细胞来源胰岛细胞活性检测方法技术

技术编号：40708466 阅读：3 留言：0更新日期：2024-03-22 11:09

本发明专利技术公开了一种人多能干细胞来源胰岛细胞活性检测方法：待检测胰岛细胞球进行消化，制得单细胞悬液；PBS缓冲液中加入体积分数0.1～5％HSA，作为细胞保护液，单细胞悬液中加入细胞保护液，再加入PI染色液进行染色；染色后的样品进行流式检测，得到活细胞占比数据。本发明专利技术使用低浓度的PI染色液进行染色，提高染色效果，染色后的细胞用流式细胞术进行分选，采用HSA作为细胞保护液，对流式检测过程中的胰岛细胞进行保护，减少制样时间以及流式检测对胰岛细胞的损伤，维持细胞活性，可标准化规范化操作，避免人为判断误差，客观且准确的检测到了胰岛活率，重复性高，检测成本低有望应用于临床胰岛移植前活率判定。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物，涉及一种人多能干细胞来源胰岛细胞活性的检测方法。

技术介绍

1、糖尿病是一种发病率较高的慢性疾病，由于胰岛β细胞(释放胰岛素和控制葡萄糖代谢的细胞)缺乏、功能障碍或不足所致。1型糖尿病(t1dm)和晚期2型糖尿病(t2dm)患者需要终生外源性胰岛素治疗。但是，传统的输注胰岛素用来缓解糖尿病的疗法可能会导致患者对胰岛素依赖性增加，无法对糖尿病进行根治。

2、胰岛细胞移植可用于糖尿病的治疗，但胰岛细胞的供体来源很少，存在供体的匹配性、免疫排斥等问题。人类多能干细胞(psc)，包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞(ipsc)，体外分化为胰岛细胞是十年来的研究热点，体外分化胰岛细胞可以获得足够的β细胞用于糖尿病患者的细胞移植。人多能干细胞来源的细胞可以解决使用人类尸体胰岛作为供体的局限性，并作为模型系统来了解导致各种形式糖尿病的致病机制。然而，移植前胰岛数量，活性和良好的功能是取得移植成功的重要因素。

3、目前被接受及普遍运用的的评估胰岛活性的方法是使用细胞渗透酯酶底物二乙酸荧光素(fda)和穿透不健康/死亡细胞的活性探针碘化丙啶(pi)来确定胰岛制剂中活细胞的百分比。但fda/pi染色后胰岛活率的判断没有确定的计量标准，主要依靠临床前医师的主观判断，并给出关于胰岛活性的估计值，没有定量数据直观表明胰岛的活性，这会导致胰岛活率判断结果带有很大的主观性，也存在较大的误差。

4、因此，有必要开发一种能够标准化定量胰岛细胞活率的检测方法，为临床应用提供准确的数据参考，便于产品质量控制和验证。</p>

技术实现思路

1、本专利技术的目的是提供一种人多能干细胞来源胰岛细胞活性检测方法，该方法能够标准化操作，不受人主观判断影响，准确定量，数据更为准确。

2、本专利技术采用的技术方案是：

3、一种人多能干细胞来源胰岛细胞活性检测方法，所述方法包括以下步骤：

4、(1)待检测胰岛细胞球进行消化，制得单细胞悬液；

5、所述待检测胰岛细胞球为人多能干细胞来源胰岛细胞球，是将人多能干细胞经过化学小分子诱导培养得到。

6、(2)pbs缓冲液中加入体积分数0.1～5％hsa，作为细胞保护液，单细胞悬液中加入细胞保护液，再加入pi染色液进行染色；

7、(3)染色后的样品进行流式检测，得到活细胞占比数据。

8、所述步骤(2)中，pbs缓冲液为市售1x pbs缓冲液。

9、所述步骤(2)中，单细胞悬液、细胞保护液的体积比为200:80～120，pi染色液的浓度为0.02～0.04mg/ml，单细胞悬液、pi染色液的体积比为200:20～40。

10、优选细胞保护液中hsa的体积分数为1.5～5％，更优选5％。

11、进一步，优选所述步骤(2)中，每200μl单细胞悬液中加入100μl细胞保护液，并加入0.025mg/ml的pi染色液30μl。

12、pi染色液是将pi溶于pbs缓冲液制得。

13、染色时间优选在常温下避光染色10～20min。

14、本专利技术发现，单细胞悬液终止消化后直接上机检测，会导致细胞容易死亡，活率较低，申请人筛选发现hsa(人血清白蛋白)对细胞有保护作用，加入hsa可以维持细胞活性，提高胰岛细胞活率。

15、所述步骤(1)中，优选采用accutase酶进行消化。消化一般是在37℃温度下消化15～25min，优选20min。

16、具体的，优选步骤(1)按以下步骤进行：

17、20μl待检测胰岛细胞球加入1mlaccutase酶，37℃温度下消化15～25min，优选消化20min，制得单细胞悬液。

18、消化时间太短，胰岛细胞消化不完全，流式细胞仪检测结果不准确，染料无法染到所有细胞。消化时间太长，会导致细胞死亡，同样导致结果不准。

19、本专利技术的有益效果在于：

20、使用低浓度的pi染色液进行染色，提高染色效果，染色后的细胞用流式细胞术进行分选，其中采用hsa作为细胞保护液，对流式检测过程中的胰岛细胞进行保护，减少流式检测对胰岛细胞的损伤，维持细胞活性，也可在较长的制样时间中，对细胞进行保护，得到的数据准确可靠，可标准化规范化操作，避免人为判断误差，客观且准确的检测到了胰岛活率，重复性高，采用pi染色与现有pi/fda染色方法接近，易被临床认可，有望应用于临床胰岛移植前活率判定，对临床产品进行质量控制，也可用于各种筛选实验验证。

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【技术保护点】

1.一种人多能干细胞来源胰岛细胞活性检测方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述待检测胰岛细胞球为人多能干细胞来源胰岛细胞球，是将人多能干细胞经过化学小分子诱导培养得到。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，细胞保护液中HSA的体积分数为5％。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，单细胞悬液、细胞保护液的体积比为200:80～120。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，PI染色液的浓度为0.02～0.04mg/mL，单细胞悬液、PI染色液的体积比为200:20～40。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，每200μL单细胞悬液中加入100μL细胞保护液，并加入0.025mg/mL的PI染色液30μL，所述细胞保护液中HSA的体积分数为5％。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，染色是在常温下避光染色10～20min。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，消化是在37℃温度下消化15～25min。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)按以下步骤进行：

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【技术特征摘要】

1.一种人多能干细胞来源胰岛细胞活性检测方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述待检测胰岛细胞球为人多能干细胞来源胰岛细胞球，是将人多能干细胞经过化学小分子诱导培养得到。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，细胞保护液中hsa的体积分数为5％。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，单细胞悬液、细胞保护液的体积比为200:80～120。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，pi染色液的浓度为0.02～0.04mg/ml，单细胞悬液、pi染色液的体积比为200:20～4...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴双双，司雨欣，曹楠，
申请(专利权)人：杭州瑞普晨创科技有限公司，
类型：发明
国别省市：

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