【技术实现步骤摘要】
本专利技术所涉及的领域为冷冻电镜领域，特别是涉及一种冷冻电镜制样装置及其制样方法。
技术介绍
1、冷冻电镜技术(cryo-em)是一种高分辨率的电子显微镜技术，它能够在冷冻的状态下获得样品的高质量的电子显微图像。与传统电镜技术不同的是，冷冻电镜技术不需要对样品进行染色和切片处理，因此能够更加准确地观察到生物分子的结构和组装方式。这项技术已经被广泛应用于生命科学领域，包括细胞生物学、生物化学、生物物理学和生物医学等领域。
2、单颗粒技术是用冷冻电镜解析生物大分子结构的主流技术之一。冷冻电镜单颗粒技术用于蛋白质等生物大分子结构解析时，样品制备是非常关键的步骤，常常决定着后续实验的成败。冷冻电镜适用的玻璃态样品厚度一般在50-200nm之间，在这个范围内，样品足够薄，电子束能够穿透并形成高分辨率的影像。如果样品过厚，电子束会被散射和吸收，影像质量会受到影响，最糟糕的情况是电子束无法穿透样品层，导致观测到的影像漆黑一片，此类样品无法用于冷冻电镜分析。因此，冷冻电镜样品制备时需要控制好样品的厚度，以获得高质量的电镜成像。如何制备得到具有合适冰层厚度的冷冻电镜样品，提高冷冻电镜制样和观测的成功率，是目前学术界研究的热点之一。
3、目前主流的应用于单颗粒结构解析技术的冷冻电镜样品制备方法，是使用专用的冷冻制样设备或手工制样(样品厚度控制方法：用滤纸吸收载网表面多余样品)，该方法介绍如下：
4、使用冷冻制样设备(如vitrobot)进行半自动化的冷冻电镜制样。其主要依靠人工将3-5μl样品注射到冷冻电镜载网上
5、上述常规主要方法的优点是制样方法简单，但其缺点也比较明显，需要尝试和优化的实验参数太多，特别是用滤纸吸收多余样品来制备得到只有几十至几百纳米厚度的样品，其可重现性和成功率太低。
6、因此，国内外有许多研究组围绕冷冻电镜制样领域开展了大量研究工作，提出了许多提高制样成功率和重现性的方法，主要分为以下几类：
7、1.对冷冻电镜载网表面进行化学修饰，附着亲水性的材料，吸收多余的样品，以达到减薄样品液层厚度的目的，提高冷冻电镜制样的成功率。(样品厚度控制方法：通过对载网表面进行化学修饰亲水材料，吸收多余样品)
8、2.采用喷雾、压电喷射等方法，在降低样品液滴体积至纳升、皮升级的同时，在同一片冷冻电镜载网的不同区域喷射样品液滴，以减小样品液层的厚度，同时增加可用的含样品的载网面积，提高冷冻电镜制样的成功率。(样品厚度控制方法：通过降低样品上样体积，以及在载网表面不同位置喷射大量样品液滴，以增加获得合适样品厚度区域的概率)
9、3.采用探针、毛细管等在载网表面涂覆超微量样品，以减小样品液层的厚度。(样品厚度控制方法：通过降低样品上样体积，并通过样品在载网表面的自发扩散，以降低样品厚度)
10、4.使用气吹、蒸发等方式，减薄载网表面过多的液体样品。(样品厚度控制方法：通过样品蒸发等方式，以降低样品厚度)
11、相比用半自动冷冻制样仪器或手工制样，上述冷冻电镜制样技术在一定程度上提高了单颗粒冷冻电镜制样实验的成功率和重现性，但仍存在以下不足：
12、(1)在上述冷冻电镜制样过程中，无法实时检测到冷冻电镜载网表面样品液层的厚度变化情况，只能依靠经验和多次重复实验摸索合适的制样条件，以及决定何时将载网投入冷冻剂中冷冻。导致最终制备得到的冷冻电镜样品的玻璃态冰层厚度不可控，存在随机性，制样成功率低。
13、(2)不具备通用性(本质上为上述样品液层厚度控制方法会受样品理化性质影响)。比如通过经验和多次重复实验摸索出了样品a的合适制样条件，但如果把样品换成浓度、缓冲液组成、黏度等理化性质都不同的样品b，制备出合适厚度样品的制样条件也会发生变化，无法直接套用样品a的制样条件。
技术实现思路
1、为解决上述不足，本专利技术提出了一种可实时检测和控制载网表面样品厚度的冷冻电镜制样装置及其制样方法。
2、本专利技术的具体实施方案如下：
3、本专利技术提供了一种能够实时检测和控制载网表面样品厚度的冷冻电镜制样装置，包括：
4、离心模块，包括离心机，离心机的转轴为水平布置且端部设有在离心时在竖向平面内转动的载网离心支架，在所述载网离心支架的端部具有用于放置载网的位置；
5、检测模块，包括用于实时检测载网上样本厚度的光谱仪和光谱仪光源，
6、检测时，光谱仪光源发出检测光照射在载网的离心路径上，当载网上的样本在离心转动过程中被检测光照射到时，检测光反射并被所述光谱仪检测到。
7、本专利技术中，离心模块可实现对冷冻电镜载网表面液体样品的减薄，检测模块按照预定的采样间隔，对冷冻电镜载网表面液体样品厚度进行检测，当厚度达到预设范围内，即可停止离心模块的运作。
8、作为优选，还包括冷冻模块，所述冷冻模块包括用于放置冷冻剂的冷冻剂储存容器，
9、冷冻模块负责将达到预设范围的冷冻电镜载网表面液体样品进行快速冷冻。
10、作为优选，冷冻模块采用泡沫杜瓦储存冷冻剂。采用液态乙烷作为冷冻剂。泡沫杜瓦中心外围装有液氮，液氮内浸没有冷冻电镜载网样品盘，用于储存已经完成制样的冷冻电镜载网。
11、本专利技术中，所述冷冻模块位于所述离心模块的下方，所述冷冻模块和所述离心模块能够相对移动使得离心完成后的样本伸入到所述冷冻剂储存容器中浸泡冷冻剂；
12、作为优选，所述冷冻模块和所述离心模块能够相对移动的情况包括：当所述冷冻模块固定时，所述离心模块可以通过驱动滑块在直线滑台上向所述冷冻模块移动；
13、当所述竖向臂固定时，所述冷冻模块向所述离心模块移动，所述冷冻模块可以通过升降台或者其他移动装置项所述离心模块移动，使得离心完成后的样本伸入到所述冷冻剂储存容器中浸泡冷冻剂。
14、移动装置可以选择多种具有转移输送功能的结构，比如可以采用电机以及受电机驱动的输送臂结构，或者也可以采用电机以及电机驱动的同步带滑台结构，或者是气缸或者液压缸等作为驱动件驱动的快速移动装置或是升降台等。
15、作为优选，所述冷冻电镜制样装置还包括可进出的制样室，在该制样室内所述离心模块和所述检测模块完成所述的离心和检测操作；所述制样室壳体上设有循环风扇结构。
16、作为进一步优选，以及还包括对所述制样室进行温度和湿度控制的控温控湿模块。
17、作为优选，所述载网离心支架在远离转轴端具有放置载网的卡槽，所述卡槽的底面有导流槽，所述导流槽延伸到所述载网离心支架的外表面，
18、所述卡槽用于固定载网，卡槽可将载网边缘卡紧，载网上表面本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种能够实时检测和控制载网表面样品厚度的冷冻电镜制样装置，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述能够实时检测和控制载网表面样品厚度的冷冻电镜制样装置，其特征在于，还包括冷冻模块，所述冷冻模块包括用于放置冷冻剂的冷冻剂储存容器，
3.根据权利要求2所述能够实时检测和控制载网表面样品厚度的冷冻电镜制样装置，其特征在于，所述冷冻模块和所述离心模块能够相对移动的情况包括：当所述冷冻模块固定时，所述离心模块通过驱动滑块在直线滑台上向所述冷冻模块移动；
4.根据权利要求1所述能够实时检测和控制载网表面样品厚度的冷冻电镜制样装置，其特征在于，所述载网离心支架在远离转轴端具有放置载网的竖向的卡槽，所述卡槽的底面有导流槽，所述导流槽延伸到所述载网离心支架的外表面，
5.根据权利要求1所述能够实时检测和控制载网表面样品厚度的冷冻电镜制样装置，其特征在于，所述载网为铜网、钼网或金网；
6.一种能够实时检测和控制载网表面样品厚度的冷冻电镜制样方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述冷冻电镜制样方法，其特征在于
8.根据权利要求6所述冷冻电镜制样方法，其特征在于，步骤(2)中，所述离心机的离心转速为100-5000rpm；
9.根据权利要求6所述冷冻电镜制样方法，其特征在于，步骤(2)中，所述光谱仪的测量波长范围为200-1100nm，分辨率＜1nm，光谱采集时间＜20ms/次，检测样本液层厚度范围为2nm-200μm，
10.根据权利要求6所述冷冻电镜制样方法，其特征在于，使用权利要求1～5任一所述能够实时检测和控制载网表面样品厚度的冷冻电镜制样装置进行制样。
...【技术特征摘要】
1.一种能够实时检测和控制载网表面样品厚度的冷冻电镜制样装置，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述能够实时检测和控制载网表面样品厚度的冷冻电镜制样装置，其特征在于，还包括冷冻模块，所述冷冻模块包括用于放置冷冻剂的冷冻剂储存容器，
3.根据权利要求2所述能够实时检测和控制载网表面样品厚度的冷冻电镜制样装置，其特征在于，所述冷冻模块和所述离心模块能够相对移动的情况包括：当所述冷冻模块固定时，所述离心模块通过驱动滑块在直线滑台上向所述冷冻模块移动；
4.根据权利要求1所述能够实时检测和控制载网表面样品厚度的冷冻电镜制样装置，其特征在于，所述载网离心支架在远离转轴端具有放置载网的竖向的卡槽，所述卡槽的底面有导流槽，所述导流槽延伸到所述载网离心支架的外表面，
5.根据权利要求1所述能够实时检测和控制载网表面样品厚度的冷冻电镜制样装置...
【专利技术属性】
技术研发人员：潘建章，王建伟，方群，王礼俊，
申请(专利权)人：浙江大学杭州国际科创中心，
类型：发明
国别省市：
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