【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及小麦遗传育种，具体涉及一种小麦苗期抗冻性基因tarpm1-7bl的功能标记及标记检测方法。
技术介绍
1、小麦是全球约40％人口的主食，也是我国种植面积第二的重要粮食作物。然而，越冬期的气温骤降和持续的霜冻天气经常导致小麦在苗期遭遇冻害。冻害限制了小麦的地理分布，威胁其生长发育，最终影响小麦的产量和品质。据统计，全球每年因冻害造成的经济损失高达数千亿元。培育并种植抗冻性较强的小麦品种是减轻冻害灾害的最经济、安全且有效的根本途径。克隆抗冻基因，开发功能标记，有助于通过分子标记辅助育种手段加快抗冻小麦新品种的选育进程。
2、抗冻性ft(freezing tolerance)受遗传和环境因素共同影响。其中遗传因素主要包括：冬春性、生长势、春化特性、光周期特性、冷驯化等；环境因素主要包括：播种日期和深度、化学干预、土壤性质、光照条件、水分以及各种胁迫因素。目前已克隆的小麦苗期抗冻基因较少，不利于通过基因聚合的手段对小麦品种的抗冻性进行遗传改良。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种小麦苗期抗冻性基因tarpm1-7bl的功能标记及标记检测方法，以解决现有技术的不足。
2、为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、小麦苗期抗冻性基因tarpm1-7bl的功能标记方法，所述抗冻基因tarpm1-7bl包括4对克隆引物seq no.1；该抗冻基因在抗冻单倍型hap1小麦品种中的编码区序列为seqno.2，在冻害敏感单倍型hap2小
4、所述抗冻基因tarpm1-7bl的caps标记名称为caps-tarpm1-7bl；
5、所述抗冻基因tarpm1-7bl的功能标记方法具体包括以下步骤：
6、s1、利用dnaman软件对tarpm1-7bl在若干份小麦品种的外显子序列信息以及在若干个抗冻性不同的品种中的测序信息进行拼接和比对，得到tarpm1-7bl基因在抗冻和冻害敏感品种间的序列差异；
7、s2、根据tarpm1-7bl基因在抗冻和冻害敏感品种间的序列差异，利用premierpremier 5.0软件设计基因特异性引物，并开发caps标记：caps-tarpm1-7bl。
8、进一步地，所述步骤s2具体通过以下方法实现：
9、首先从tarpm1-7bl基因中选取一段同源性低，且在抗冻和冻害敏感品种间存在差异的序列；
10、然后利用premierpremier 5.0软件针对该序列设计特异性的引物，并使用引物对差异片段进行扩增；
11、再通过可以区分该差异序列的限制性内切酶mspi，对扩增产物进行酶切；
12、将酶切产物进行凝胶电泳，即可依据差异的带型进行tarpm1-7bl的基因型区分，并开发caps标记：caps-tarpm1-7bl。
13、进一步地，所述caps标记caps-tarpm1-7bl的上下游引物序列为seq no.4。
14、进一步地，该检测方法具体包括以下步骤：
15、s1、进行pcr扩增体系配置：1μl 2.5mm dntp，0.25μl 10μm的caps-tarpm1-7bl的标记特异性引物，1μl 10×easytaq buffer，0.5u easytaq，100ng dna模板，用双蒸馏水补齐到10μl；
16、s2、执行pcr扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s；62℃开始每循环降落0.3℃退火30s；72℃延伸30s，40个循环；72℃延伸8min；
17、s3、进行扩增后酶切体系配制：5μl pcr产物，1μl 10×cutsmart buffer，0.5umspi，用双蒸馏水补齐到10μl；
18、s4、执行酶切反应程序：在37℃酶切8h后，在样品中加入3μl 6×dna loadingbuffer，取5μl酶切后产物用2.5％的琼脂糖凝胶电泳分型；
19、所述caps标记在抗冻单倍型hap1小麦品种对应的扩增产物的核苷酸序列为seqno.5，在冻害敏感单倍型hap2小麦品种对应的扩增产物的核苷酸序列为seq no.6。
20、由以上技术方案可知，本专利技术利用全基因组关联分析方法鉴定得到一个调控小麦苗期抗冻性的新基因tarpm1-7bl(traescs7b02g316700)；并利用qrt-pcr和病毒诱导的基因沉默(vigs)试验验证了该基因的功能。tarpm1-7bl基因在编码区有20处错义突变，形成了抗冻和冻害敏感2种单倍型(hap1和hap2)；同时开发出了易于大规模批量检测hap1和hap2的caps标记，该caps标记经电泳检测后条带清晰可辩，不同抗冻性的小麦品种间带型差异明显，检测方法简便，有助于提高分子标记选择的目标性和针对性，提高了小麦抗冻性遗传改良的效率。
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1.小麦苗期抗冻性基因TaRPM1-7BL的功能标记方法，其特征在于，所述抗冻基因TaRPM1-7BL包括4对克隆引物SEQ NO.1；该抗冻基因在抗冻单倍型Hap1小麦品种中的编码区序列为SEQ NO.2，在冻害敏感单倍型Hap2小麦品种中的编码区序列为SEQ NO.3；
2.根据权利要求1所述的小麦苗期抗冻性基因TaRPM1-7BL的功能标记方法，其特征在于，所述步骤S2具体通过以下方法实现：
3.根据权利要求1所述的小麦苗期抗冻性基因TaRPM1-7BL的功能标记方法，其特征在于，所述CAPS标记CAPS-TaRPM1-7BL的上下游引物序列为SEQNO.4。
4.根据权利要求1所述的小麦苗期抗冻性基因TaRPM1-7BL的功能标记的检测方法，其特征在于，该检测方法具体包括以下步骤：
【技术特征摘要】
1.小麦苗期抗冻性基因tarpm1-7bl的功能标记方法，其特征在于，所述抗冻基因tarpm1-7bl包括4对克隆引物seq no.1；该抗冻基因在抗冻单倍型hap1小麦品种中的编码区序列为seq no.2，在冻害敏感单倍型hap2小麦品种中的编码区序列为seq no.3；
2.根据权利要求1所述的小麦苗期抗冻性基因tarpm1-7bl的功能标记方法，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：潘旭，张海萍，常成，卢杰，马传喜，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：
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