【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于肿瘤类器官领域，具体涉及一种高效的孤立性纤维瘤类器官培养基和培养方法。
技术介绍
1、孤立性纤维瘤属于纤维母细胞/肌纤维母细胞来源的少见软组织肿瘤，常伴有纤维性假包膜，质韧而有弹性。运用类器官培养技术体外自组装孤立性纤维瘤类器官为研究孤立性纤维瘤发生发展以及探索各种治疗手段提供了重要的模型。
2、与常见的上皮源性肿瘤不同，孤立性纤维瘤是一种间质来原的肿瘤。已有的孤立性纤维瘤类器官培养将新鲜的孤立性纤维瘤碾碎成1mm3大小的组织块，去除红细胞后加入类器官培养基：添加10%胎牛血清的dmem或无血清培养基，含有neurobasal medium，n-2，b-27，双抗，fgf（50 ng/ ml），egf（50 ng/ml），并采用tryple酶消化和机械打散的方法进行细胞传代。采用该方法进行孤立性纤维瘤类器官培养不仅获取的细胞少，而且扩增慢，成功率低。
技术实现思路
1、本专利技术为克服现有孤立性纤维瘤类器官培养存在的培养成功率低、扩增慢等缺点，建立一种更高效的孤立性纤维瘤类器官培养基和培养扩增方法，具体包括以下两个方面：i、孤立性纤维瘤类器官培养基：对已有培养基进行优化的基础上建立的一种新的组分和配比的培养基；ii、孤立性纤维瘤类器官培养方法：针对孤立性纤维瘤韧性强，组织样本和形成的类器官中含有较多的胶原纤维，建立一种基于组织消化酶的长时间温和消化方法。
2、i、孤立性纤维瘤类器官培养基：包括基础培养基dmem/f12、r-spondin 10
3、优选的，基础培养基dmem/f12、r-spondin 50-200ng/ml、noggin 50-200ng/ml、egf 30-70ng/ml、fgf10 80-120ng/ml、fgf7 15-30ng/ml、b27 0.7-1.5%、n-acetylcysteine 0.8-1.5 mm、nicotinamide 5-15mm、gastrin 5-15nm、a83-01 0.2-0.8um、primocin 80-120μg/ml、青霉素-链霉素 分别为80-120u/ml和80-120mg/ml、y27632 5-10um。
4、ii、孤立性纤维瘤类器官培养方法：为更好地酶解富含胶原基质的孤立性纤维瘤组织和致密的类器官，我们建立了一种不同于经典的组织酶解和类器官传代消化方法，使用由含血清的完全培养基配制的组织消化酶长时间温和消化离解孤立性纤维瘤组织和类器官，进行类器官培养和传代，基本步骤如下：新鲜的孤立性纤维瘤组织，用剪刀剪成1-3mm3；加入组织消化酶液，置于37℃、5%co2孵箱中孵育3-10小时；孵育结束后，用移液管轻轻吹打分散细胞，70-100μm滤网过滤后，离心收集细胞进行三维类器官培养；形成的类器官用组织消化酶于37℃、5%co2孵箱中孵育3-10小时温和消化分散细胞，离心收集细胞进行传代培养。
5、上述的原代类器官培养，按如下步骤进行：将新鲜的孤立性纤维瘤组织样本，用含100u/ml青霉素和100mg/ml链霉素的pbs清洗后，剪成1-3mm3小块。加入组织消化酶，于37℃、5%co2孵箱中消化3-10小时；消化结束后，用移液管轻轻吹打分散细胞，用70-100um滤网过滤去除未消化完全的组织块。200-300g离心3-10分钟去上清，在得到的细胞沉淀中加入2-5倍沉淀体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，100-300g离心3-5分钟去上清。加入孤立性纤维瘤类器官培养基重悬细胞，并在细胞悬液中添加2-20%的matrigel，混匀，整个操作在冰上进行。将细胞悬液与matrigel的混合物接种到12孔或24孔超低吸附培养板中，每孔接种100-300ul，置于37℃、5%co2培养箱中孵育20-30分钟。孵育结束后，每孔加入100-300ul类器官培养基，置于37℃、5%co2培养箱中培养形成类器官。
6、上述孤立性纤维瘤类器官传代培养，按如下方案进行：孤立性纤维瘤类器官经轻微吹打使matrigel散开后，加入组织消化酶，于37℃、5%co2孵箱中消化3-10小时；消化结束后，用移液管轻轻吹打分散细胞，200-300g离心3-10分钟去上清。加入孤立性纤维瘤类器官培养基重悬细胞，并在细胞悬液中添加2-20%的matrigel，混匀，整个操作在冰上进行。将细胞悬液与matrigel的混合物接种到12孔或24孔超低吸附培养板中，每孔接种100-300ul，置于37℃、5%co2培养箱中孵育20-30分钟。孵育结束后，每孔加入100-300ul类器官培养基，置于37℃、5%co2培养箱中进行类器官传代培养。
7、上述的组织消化酶：含有dmem基础培养基、5-20%胎牛血清、0.1-2mg/ml的iv型胶原酶，y27632 1um-20um，primocin 80-120μg/ml，100u/ml青霉素/100mg/ml链霉素。
8、与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：通过用含5-20%血清的dmem/f12培养基配制的0.1-2mg/ml的iv型胶原酶溶液对原始孤立性纤维瘤组织和类器官进行长时间温和消化，可以充分的打散原始组织或类器官使细胞释放出来形成单细胞悬液，并能最大限度地保持细胞活性。更重要的是本专利技术的类器官培养基可促进孤立性纤维瘤类器官形成和生长，提高培养效率。
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1.一种高效的孤立性纤维瘤类器官培养基和培养方法，其特征在于，包括孤立性纤维瘤类器官培养基以及基于组织消化酶温和消化和类器官培养基的培养方法。
2.如权利要求1所述的孤立性纤维瘤类器官培养基，其特征在于，包括：
3.如权利要求1所述的基于组织消化酶温和消化和类器官培养基的培养方法，其特征在于，包括将新鲜的孤立性纤维瘤组织剪成1-3mm3后，用组织消化酶温和消化3-10小时获取原代细胞；在类器官传代过程中，用组织消化酶温和消化3-10小时打散类器官；用孤立性纤维瘤类器官培养基进行类器官培养。
4.如权利要求3所述的组织消化酶，其特征在于，由5-20%胎牛血清、基础培养基、0.1-0.5%的IV型胶原酶和青霉素-链霉素组成。
5.如权利要求4所述的基础培养基，其特征在于，可以是DMEM、DMEM/F12、RPMI 1640、MEM等。
6.如权利要求3所述的组织消化酶温和消化，其特征在于，在组织或类器官样本中加入5-10倍体积的组织消化酶于37℃、5%CO2孵箱中孵育消化。
7.如权利要求1所述的孤立性纤维瘤类器
...【技术特征摘要】
1.一种高效的孤立性纤维瘤类器官培养基和培养方法，其特征在于，包括孤立性纤维瘤类器官培养基以及基于组织消化酶温和消化和类器官培养基的培养方法。
2.如权利要求1所述的孤立性纤维瘤类器官培养基，其特征在于，包括：
3.如权利要求1所述的基于组织消化酶温和消化和类器官培养基的培养方法，其特征在于，包括将新鲜的孤立性纤维瘤组织剪成1-3mm3后，用组织消化酶温和消化3-10小时获取原代细胞；在类器官传代过程中，用组织消化酶温和消化3-10小时打散类器官；用孤立性纤维瘤类器官培养基进行类器官培养。
4.如权利要求3所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨洋，赵云山，赵维婷，黄洋，张铭浩，刘磊，
申请(专利权)人：黑玉星岩国际科学技术北京有限公司，
类型：发明
国别省市：
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