一种模拟体内微环境肝癌类器官制备方法技术

本发明专利技术属肿瘤类器官领域，具体提供一种模拟体内微环境肝癌类器官制备方法。该方法通过在肝癌类器官培养体系中添加肝窦内皮细胞和肿瘤相关成纤维细胞、肝组织脱细胞基质和细胞因子分别为肝癌细胞提供细胞微环境、基质微环境和因子微环境。肝癌细胞先在在基质胶中形成类器官，之后按照1：(100

【技术实现步骤摘要】
一种模拟体内微环境肝癌类器官制备方法
[0001]所属领域
[0002]本专利技术属肝癌类器官领域，具体涉及一种模拟体内微环境肝癌类器官制备方法。

技术介绍

[0003]肝癌类器官是一种基于三维培养技术和组织生长因子调控方法而在体外培养的肿瘤微组织。肿瘤类器官重演体内肿瘤生长特征，高保真地保留了体内肿瘤特征，在形态结构、生长特性、遗传特征等方面与体内肿瘤高度相似。肿瘤类器官的这些特性使其近年来被用作研究模型，在肿瘤发生、发展、耐药机理等相关基础研究及药敏检测方面被广泛应用。
[0004]肝肿瘤细胞微环境由肿瘤细胞、与癌症相关的成纤维细胞、以及细胞细胞因子和细胞外基质中的非细胞成分构成。肝肿瘤细胞微环境对肿瘤细胞的生物学特性形成产生重要影响，在肿瘤发生、发展及转移过程发挥重要作用。肿瘤相关成纤维细胞主要分布在肿瘤边缘，具有促进血管生成、抑制免疫细胞表型、诱导化疗耐药性等促进肿瘤的增殖、侵袭和转移的能力。肿瘤中的血管内皮细胞生成调节因子激活，促进肿瘤生长。肝癌中细胞外基质对肿瘤的发生发展中起着重要作用。这些结果表明肿瘤微环境对肿瘤发展有重要影响。
[0005]专利“一种肝癌类器官模型的体外构建方法(CN 110004109 A)“虽然提供一种包括肝癌细胞、肝窦内皮细胞和肝星状细胞类器官构建方法，但缺乏肝细胞外基质环境和肝细胞，因而在微环境模拟上是不全面的。
[0006]本专利提供一种模拟体内微环境肝癌类器官制备方法，基于该方法构建一种更加接近体内肿瘤微环境的类器官。

技术实现思路

[0007]本专利技术专利提供一种模拟体内微环境肝癌类器官制备方法。本专利技术通过在肝癌类器官培养体系中添加肝非实质细胞为其提供细胞微环境，添加肝组织脱细胞基质提供细胞外基质微环境，添加细胞因子提供因子微环境，其制备方法包括如下步骤：
[0008]1)将肝癌细胞在matrigel基质和培养基A中培养形成肝癌类器官。
[0009]2)将步骤1)中形成的肝癌类器官与肿瘤相关成纤维细胞、肝窦内皮细胞和肝细胞外基质凝胶复合形成肝癌类器官/肝肺实质细胞/肝细胞外基质复合物。
[0010]3)将肝癌类器官/肝肺实质细胞/肝细胞外基质复合物接种低吸附培养板中，加入培养基B进行培养，形成模拟体内微环境肝癌类器官。
[0011]步骤1)所述肝癌类器官按如下方法制备：根据本领域公知技术肝癌细胞与matrigel混合制备成0.5
‑
1X10*5细胞/，接种培养皿中，加入培养基A，置于37℃、5％CO2孵箱中培养7
‑
14d。
[0012]上述TrypLE购于Gibco，matrigel购于Corning公司。
[0013]上述培养基A按如下配方配制：Advanced DMEM(GIBCO)添加1:50B
‑
27(GIBCO)，1:100N
‑
2(GIBCO)，10mM nicotinamide(Sigma)，1.25mM N
‑
acetyl
‑
L
‑
cysteine(Sigma)，10nM gastrin(Sigma)，10mM forskolin(Tocris)，5mM A83
‑
01(Tocris)，50ng/mL EGF
(PeproTech)，100ng/mL FGF10(PeproTech)，25ng/ml HGF(PeproTech)，10％RSpo1条件培养基(自制)，30％Wnt3a条件培养基(自制)。
[0014]上述肝癌细胞从肝癌组织中分离获得，按如下方法制备：新鲜肝癌组织，用PBS(500U/mL青霉素和500μg/mL链霉素)清洗去除表面血块。剪刀剪碎后，移入50ml离心管中，加入胶原酶D(0.1
‑
0.5mg/ml)，37℃振荡消化20
‑
40分钟。消化后的肝癌组织用70
‑
100um滤网过滤，去除未消化的组织。滤液经50
‑
100g离心力离心5min，分成非实质细胞悬液和肝癌细胞沉淀，将非实质细胞悬液转移至另一离心管中用于血管内皮和肿瘤相关成纤维细胞分离；肝癌细胞沉淀经Advanced DMEM重悬后，100g离心5min，去上清，收集沉淀即得。
[0015]步骤2)所述的肝癌类器官/肝肺实质细胞/肝细胞外基质复合物，按如下方法制备：将步骤1)制备的肝癌类器官与肿瘤相关成纤维细胞、血管内皮细胞的按比例为1：(100
‑
1000)：(100
‑
1000)制成悬液，再与肝脱细胞基质凝胶等比例混合，用移液管吹打均匀后即形成肝癌类器官/肝肺实质细胞/肝细胞外基质复合物。上述肿瘤相关成纤维细胞是为了给肝癌类器官提供细胞微环境，其制备按如下方法进行：根据本领域公知技术，将步骤1)中非实质细胞悬液200
‑
250g离心力离心5
‑
10min后，弃上清，用含5
‑
15％胎牛血清(FBS，Gibco)的高糖DMEM完全培养液均匀吹散获取的细胞，均匀分装至6cm培养皿中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，待细胞贴壁后，用无菌PBS轻柔清洗培养皿，肿瘤相关成纤维能够贴住皿底，而其他细胞在适当力度的PBS冲洗下会从皿底滑落，经纯化后的CAF继续培养扩增至1
‑
2周。
[0016]上述血管内皮细胞按如下方法制备：根据本领域公知技术，将步骤1)中非实质细胞悬液以200
‑
250g离心力离心5
‑
10min，得到非实质细胞沉淀，加入DMEM重悬后，200
‑
250g离心10min，然后用完全培养基重悬。为分离非实质细胞中的血管内皮细胞，我们采用Percoll非密度梯度离心法。先配10
×
PBS(100ml)：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HP04.12H20 2.9g，KH2P04 0.2g，过滤除菌，4℃保存；percoll溶液(使用前配置)：10
×
PBS 5ml，Percoll原液45ml，pH 7.4，4℃冰箱保存。再配50％Percoll液15ml配制(使用时配制)：7.5ml SPS，7.5ml 1
×
PBS；25％Percoll液20ml配制(使用时配制)：5ml SPS，15ml 1
×
PBS。取50ml尖底透亮离心管倾斜，用5ml枪头沿管壁缓慢依次加入体积分数为50％的Percoll 15ml，体积分数为25％的Percoll 20ml，10ml非实质细胞悬液。900g离心20min，收集25％Percoll和50％Percoll间的富含血管内皮细胞层，加入等体积完全培养基(M199+10％胎牛血清)900g离心10min，得到血管内皮细胞沉淀，用完全培养基重悬。调整细胞密度为(1.5
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种模拟体内微环境肝癌类器官制备方法，其特征在于，通过在肝癌类器官培养体系中添加肝非实质细胞为其提供细胞微环境，添加肝组织脱细胞基质提供基质微环境，添加细胞因子提供因子微环境。2.如权利要求1所述的肝非实质细胞，其特征在于，为血管内皮细胞和肿瘤相关成纤维细胞。3.如权利要求2所述的血管内皮细胞和肿瘤相关成纤维细胞，其特征在于，从肝癌组织中分离获得。4.如权利要求1所述的肝组织脱细胞基质，其特征在于，来...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵云山，杨洋，李一伟，张铭浩，
申请(专利权)人：黑玉星岩国际科学技术北京有限公司，
类型：发明
国别省市：