【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药，尤其涉及一种从积雪草根际土壤中分离赖氨酸芽孢杆菌的方法以及利用该纺锤形赖氨酸芽孢杆菌转化积雪草苷和羟基积雪草苷的方法。
技术介绍
1、积雪草为伞形科积雪草属植物，性寒，味苦、辛，具有清热利湿，解毒消肿之功效，是广东地区常用中草药。积雪草原料中的高活性成分积雪草酸与羟基积雪草酸的含量很低，且远低于积雪草总苷(积雪草苷与羟基积雪草苷之和)的含量，目前为了获得积雪草酸与羟基积雪草酸成分主要采用的工艺技术有化学方法和生物方法，化学方法为将积雪草苷与羟基积雪草苷进行酸水解或碱水解的方法，或采用有机溶剂从积雪草原料中进行提取分离，当采用为酸水解或碱水解的工艺技术将积雪草总苷转化为积雪草酸与羟基积雪草酸，过程中会使用大量的酸或碱液，且水解反应对设备和操作条件具有相应的要求，从绿色环保与安全的角度，不是理想的方式。
2、我们前期研究发现产自湘南地区的野生积雪草资源品质好，其含有积雪草总苷含量显著高于《中国药典》的标准，并且发现同一处生长地的积雪草，一年当中不同月份所含积雪草总苷含量具有显著的差异，随月份增加呈现先增加后降低的趋势，气温较高的5～8月其含量显著高于其他月份，结合大量的文献查阅，推测积雪草中积雪草总苷成分的变化与积雪草生长环境中的微生物(根际微生物与内生菌)存在一定的关联。故本专利技术的目的在于从积雪草生长地的根际土壤中发现对转化积雪草总苷有相关作用的菌株，并利用该菌株进行转化积雪草总苷实验获得积雪草酸与羟基积雪草酸成分。
3、目前关于积雪草根际微生物与内生菌的研究较少，且没有从积雪草
技术实现思路
1、为了克服现有技术中的技术问题，本专利技术提供一种从积雪草根际土壤中分离赖氨酸芽孢杆菌的方法以及利用该纺锤形赖氨酸芽孢杆菌转化积雪草苷和羟基积雪草苷的方法，从积雪草根际土壤中筛选分离得到与积雪草活性成分积雪草苷和羟基积雪草苷有显著相关性的细菌，经鉴定为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌，利用该纺锤形赖氨酸芽孢杆菌能够高效转化积雪草苷和羟基积雪草苷产生积雪草酸与羟基积雪草酸。
2、为解决上述技术问题，本专利技术提出的技术方案如下：
3、本专利技术提供一种从积雪草根际土壤中分离纺锤形赖氨酸芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：
4、s1、取长势好的积雪草的根际土壤制成土壤悬液，依次接种到细菌富集培养基和细菌初筛培养基中，分离纯化得到不同的细菌菌株；
5、s2、将步骤s1中得到的不同细菌菌株分别接种到含有积雪草苷和羟基积雪草苷的细菌复筛培养基中，筛选出有转化积雪草苷和羟基积雪草苷作用的细菌，鉴定为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌。
6、作为一种可选的实施方式，在本专利技术提供的分离方法中，步骤s2中，所述细菌复筛培养基中积雪草苷和羟基积雪草苷的含量均≥70％。
7、作为一种可选的实施方式，在本专利技术提供的分离方法中，步骤s2中，所述细菌菌株的接种量为0.5-5％。
8、作为一种可选的实施方式，在本专利技术提供的分离方法中，步骤s1中，接种过程如下：将土壤悬液接种于细菌富集培养基中，培养完成后将培养基稀释，将稀释液涂布到lb营养琼脂平板上，培养完成后挑取形状和颜色不同的细菌接种于细菌初筛养基中培养得到分离纯化后的细菌菌株。
9、作为一种可选的实施方式，在本专利技术提供的分离方法中，步骤s2中，筛选有转化积雪草苷和羟基积雪草苷作用的细菌时，利用薄层色谱法检测，选择复筛培养基中积雪草苷和羟基积雪草苷的斑点颜色变淡，且产生了新的颜色较深、面积较大斑点的细菌作为对积雪草苷和羟基积雪草苷有转化作用的细菌。
10、作为一种可选的实施方式，在本专利技术提供的分离方法中，步骤s2中，筛选出有转化积雪草苷和羟基积雪草苷作用的细菌后，利用高效液相色谱检测细菌对积雪草苷和羟基积雪草苷的转化效率，选择转化率达到100％的细菌作为目标菌。
11、基于相同的技术构思，本专利技术还提供利用上述方法分离得到的赖氨酸芽孢杆菌转化积雪草苷和羟基积雪草苷的方法，包括以下步骤：
12、配置培养基，将赖氨酸芽孢杆菌接种至培养基中，然后在培养基中加入积雪草苷或羟基积雪草苷，培养后分别得到积雪草酸或羟基积雪草酸。
13、作为一种可选的实施方式，在本专利技术提供的转化积雪草苷和羟基积雪草苷的方法中，所述赖氨酸芽孢杆菌接种量为0.5-5％。接种量过少，容易出现培养失败或造成培养的时间过长。
14、作为一种可选的实施方式，在本专利技术提供的转化积雪草苷和羟基积雪草苷的方法中，培养温度为28～32℃，培养时间为3～10天。培养时间过短则对积雪草苷、羟基积雪草苷成分转化不完全，时间过长没必要且容易出现菌株衰败以及出现其他副产物。
15、作为一种可选的实施方式，在本专利技术提供的转化积雪草苷和羟基积雪草苷的方法中，所述积雪草苷或羟基积雪草苷的含量均≥70％。加入的积雪草苷、羟基积雪草苷样品的含量太低，其他成分过多会影响菌株的生长与转化效果。
16、与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
17、(1)本专利技术提供一种从积雪草根际土壤中分离得到可以转化积雪草苷和羟基积雪草苷的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌的方法，完善积雪草根际土壤细菌的研究内容，且得到了与积雪草活性成分积雪草苷和羟基积雪草苷有显著相关性的细菌，利用该纺锤形赖氨酸芽孢杆菌能够对积雪草苷和羟基积雪草苷进行高效转化产生积雪草酸与羟基积雪草酸，为今后开展积雪草药材种植过程与开发利用中实现积雪草苷和羟基积雪草苷的高效转化与富集提供有效的参考。
18、(2)本专利技术为积雪草高活性成分积雪草酸与羟基积雪草酸的高效、绿色、安全的制备提供更多的选择。
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1.一种从积雪草根际土壤中分离赖氨酸芽孢杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的从积雪草根际土壤中分离赖氨酸芽孢杆菌的方法，其特征在于，步骤S2中，所述细菌复筛培养基中积雪草苷和羟基积雪草苷的含量均≥70％，所述细菌菌株的接种量为0.5-5％。
3.根据权利要求1所述的从积雪草根际土壤中分离赖氨酸芽孢杆菌的方法，其特征在于，步骤S1中，接种过程如下：将土壤悬液接种于细菌富集培养基中，培养完成后将培养基稀释，将稀释液涂布到LB营养琼脂平板上，培养完成后挑取形状和颜色不同的细菌接种于细菌初筛养基中培养得到分离纯化后的细菌菌株。
4.根据权利要求1所述的从积雪草根际土壤中分离赖氨酸芽孢杆菌的方法，其特征在于，步骤S2中，筛选有转化积雪草苷和羟基积雪草苷作用的细菌时，利用薄层色谱法检测，选择复筛培养基中积雪草苷和羟基积雪草苷的斑点颜色变淡，且产生了新的颜色较深、面积较大斑点的细菌作为对积雪草苷和羟基积雪草苷有转化作用的细菌。
5.根据权利要求1所述的从积雪草根际土壤中分离纺氨酸芽孢杆菌的方法，其特征在于，步骤S2中，
6.利用权利要求1-5任一所述的从积雪草根际土壤中分离赖氨酸芽孢杆菌的方法分离得到的赖氨酸芽孢杆菌转化积雪草苷和羟基积雪草苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的转化积雪草苷和羟基积雪草苷的方法，其特征在于，所述赖氨酸芽孢杆菌接种量为0.5-5％。
8.根据权利要求6所述的转化积雪草苷和羟基积雪草苷的方法，其特征在于，培养温度为28～32℃，培养时间为3～10天。
9.根据权利要求6所述的转化积雪草苷和羟基积雪草苷的方法，其特征在于，所述积雪草苷或羟基积雪草苷的含量均≥70％。
...【技术特征摘要】
1.一种从积雪草根际土壤中分离赖氨酸芽孢杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的从积雪草根际土壤中分离赖氨酸芽孢杆菌的方法，其特征在于，步骤s2中，所述细菌复筛培养基中积雪草苷和羟基积雪草苷的含量均≥70％，所述细菌菌株的接种量为0.5-5％。
3.根据权利要求1所述的从积雪草根际土壤中分离赖氨酸芽孢杆菌的方法，其特征在于，步骤s1中，接种过程如下：将土壤悬液接种于细菌富集培养基中，培养完成后将培养基稀释，将稀释液涂布到lb营养琼脂平板上，培养完成后挑取形状和颜色不同的细菌接种于细菌初筛养基中培养得到分离纯化后的细菌菌株。
4.根据权利要求1所述的从积雪草根际土壤中分离赖氨酸芽孢杆菌的方法，其特征在于，步骤s2中，筛选有转化积雪草苷和羟基积雪草苷作用的细菌时，利用薄层色谱法检测，选择复筛培养基中积雪草苷和羟基积雪草苷的斑点颜色变淡，且产生了新的颜色较深、面积较大斑点的细菌作为对...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄建华，王俊杰，陈立贵，李潘阳，邬友情，刘青，刘泽，刘芳，刘思妤，张远芳，
申请(专利权)人：湘南学院，
类型：发明
国别省市：
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