【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，更具体的，涉及靶向ush2a基因的sgrna及食蟹猴ush2a基因敲除的方法。
技术介绍
1、ush2a基因位于染色体1q41，ush2a基因编码的蛋白质usherin在人视网膜和耳蜗均有表达，对维持视网膜感光细胞和内耳毛细胞的结构和功能具有重要作用。ush2a突变可导致非综合征性视网膜色素变性(nrp)和ii型usher综合征[遗传性耳聋-色素性视网膜炎综合征(usher syndrome type ii,ush ii)]。迄今为止，ush2a基因突变型rp/ush ii发病机理不清，治疗手段有限。据统计在所有usher综合征患者中，50-75％的患者是由ush2a基因突变引起；12-25％的rp患者是因为ush2a基因突变所导致的。目前已发现超过690多种ush2a致病突变，包括剪切突变、缺失突变和错义突变等，但绝大部分突变位点属于复合杂合突变类型。甚至同一家系的相同突变，其临床表征的发展进程也存在较大差别，这些都极大增加了解析疾病遗传规律的复杂性。
2、已知ush2a突变的非综合征性视网膜色素变性(nrp)和ii型usher综合征(ush ii)有关。nrp其特征是在成年早期视觉功能逐渐下降，视网膜电图无视杆和视锥反应，这是一种进行性疾病，其特征是临床以夜盲为首发症状，患者暗适应迟缓，暗光下或夜间行走困难。双眼视野逐渐向心性缩小，早期视野环形缺损，逐渐发展成管视或全盲，视力呈进行性减退。随病情进一步发展，最终中心视力受损，半数患者中年后全盲。ush ii其特征是不仅患者成年早期视觉功能逐渐下
3、目前，在ush2a基因突变的动物模型中，仅见报道的有斑马鱼和小鼠模型。然而斑马鱼和小鼠基因突变模型的视网膜和感音病变特征与疾病进程与人类不一致，难以精准模拟ush2a突变视网膜变性疾病的发病机制和发展规律。但关于ush2a基因的编辑的灵长类模型未见报道，选用食蟹猴作为视网膜变性和感音性耳聋模型，开展相关研究相比以往在斑马鱼和啮齿类的研究更具有说服力。哺乳动物出生后不同年龄阶段视网膜内层神经元如何改变尚无详细报道，且对ush2a视网膜病变形态学的研究相对较少。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的上述问题，首先提供靶向ush2a基因的sgrna组合。
2、本专利技术的第二个目的是提供sgrna组合的应用。
3、本专利技术的第三个目的是一种靶向ush2a基因敲除的食蟹猴动物模型的构建方法。
4、本专利技术的目的通过以下技术方案实现：
5、靶向ush2a基因的sgrna组合，选自ush-1、ush-2、ush-3、ush-4，其中ush-1由sgrna1-1和sgrna1-10组成，ush-2由sgrna1-1和sgrna1-2组成，ush-3由sgrna1-1和sgrna1-7组成，ush-1由sgrna1-2和sgrna1-7组成；其中，sgrna1-1、sgrna1-2、sgrna1-7和sgrna1-10的序列分别如seq id no：1～4所示。
6、本申请提供一种靶向ush2a基因的sgrna，并进行相关的食蟹猴ush2a基因敲除，以此构建相关模型。本申请为ush2a视网膜病变造模、早期诊断、干预、阻断及治疗ush2a视网膜病变提供新思路。
7、优选的，所述的sgrna组合为ush-1。
8、本专利技术还提供所述sgrna组合的应用，至少包括以下一个方面：
9、(1)ush2a基因的敲除；
10、(2)构建/筛选遗传性耳聋-色素性视网膜炎综合征动物模型；
11、(3)构建/筛选感音神经性耳聋动物模型；
12、(4)构建/筛选视网色素变性动物模型。
13、本专利技术还提供一种靶向ush2a基因敲除的食蟹猴动物模型的构建方法，包括以下步骤：
14、(1)体外合成权利要求1或2所述的sgrna，与cas9 mrna混合后，注射入食蟹猴胚胎，得到ush2a基因敲除的食蟹猴胚胎；
15、(2)体内移植所述ush2a基因敲除的食蟹猴胚胎至代孕雌猴，获得ush2a基因敲除的子代食蟹猴。
16、该方法为食蟹猴胚胎上的基因敲除方法，该基因敲除方法敲除食蟹猴ush2a基因，进而有可能为制造非人灵长类肿瘤动物模型提供新的有效方法。
17、优选的，体外合成sgrna的操作步骤为：
18、(1)根据权利要求1或2所述的靶向敲除ush2a基因的sgrna，设计合成引物，然后以px459载体为模板，进行pcr扩增，得到转录dna模板；
19、(2)将步骤(1)制得的转录dna模板转录，得到sgrna。
20、优选的，所述引物的核苷酸序列如下：
21、ush2a grna 1-1f：
22、5’-taatacgactcactatagattgacaaaagagagaggatgggttttagagctagaaata gc-3’；
23、grnapcrr：5’-agcaccgactcggtgccactt-3’；
24、ush2a grna 1-2f：
25、5’-taatacgactcactatagcagctgataatagagtgtcacgggttttagagctagaaat agc-3’；
26、grnapcrr：5’-agcaccgactcggtgccactt-3’；
27、ush2a grna 1-7f：
28、5’-taatacgactcactataggggtccaccctttggcacagcggttttagagctagaa atagc-3’；
29、grnapcrr：5’-agcaccgactcggtgccactt-3’；
30、ush2a grna 1-10f：
31、5’-taatacgactcactatagttatcattgacaaaagagagaggttttagagctagaaata gc-3’；
32、grnapcrr：5’-agcaccgactcggtgccactt-3’。
33、与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
34、(1)本专利技术针对食蟹猴ush2a基因提供了4个高效的敲除靶点。
35、(2)本专利技术经敲除效果检测鉴定，能有效在食蟹猴胚胎和食蟹猴实现ush2a基因的敲除，为建立非人灵长类视网膜变性和感音性耳聋动物模型奠定了坚实基础。
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1.靶向Ush2a基因的sgRNA组合，其特征在于，选自USH-1、USH-2、USH-3、USH-4，其中USH-1由sgRNA1-1和sgRNA1-10组成，USH-2由sgRNA1-1和sgRNA1-2组成，USH-3由sgRNA1-1和sgRNA1-7组成，USH-1由sgRNA1-2和sgRNA1-7组成；其中，sgRNA1-1、sgRNA1-2、sgRNA1-7和sgRNA1-10的序列分别如SEQ ID NO：1～4所示。
2.根据权利要求1所述的sgRNA组合，其特征在于，所述的sgRNA组合为USH-1。
3.权利要求1或2所述sgRNA组合的应用，其特征在于，所述应用至少包括以下一个方面：
4.一种靶向Ush2a基因敲除的食蟹猴动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的食蟹猴动物模型的构建方法，其特征在于，体外合成sgRNA的操作步骤为：
6.根据权利要求5所述的食蟹猴动物模型的构建方法，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如下：
【技术特征摘要】
1.靶向ush2a基因的sgrna组合，其特征在于，选自ush-1、ush-2、ush-3、ush-4，其中ush-1由sgrna1-1和sgrna1-10组成，ush-2由sgrna1-1和sgrna1-2组成，ush-3由sgrna1-1和sgrna1-7组成，ush-1由sgrna1-2和sgrna1-7组成；其中，sgrna1-1、sgrna1-2、sgrna1-7和sgrna1-10的序列分别如seq id no：1～4所示。
2.根据权利要求1所...
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