【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及肝素偶联琼脂糖微球在纯化细胞外囊泡中的应用。
技术介绍
1、细胞外囊泡(extracellular vesicle,ev)是由细胞自然释放且不能复制的脂质双分子层颗粒(théry等,2018)。ev的直径范围为30-1000nm，其中约80％在50-500nm之间(arraud等,2014)，存在于血液、尿液、唾液、脑脊液和羊水等各种人体体液中(kalra等,2016)。ev可携带丰富的核酸、蛋白质和脂质等生物活性物质，并将其内容物从供体细胞运输到受体细胞，从而实现细胞之间的物质和信息交换。其中的生物活性分子可反映供体细胞的生理状态，故ev在疾病诊断和治疗领域具广阔临床应用前景。
2、ev的分离和纯化仍然是目前限制ev相关基础研究和临床应用的瓶颈问题。从复杂体液样品中分离高纯度ev对于了解ev的生物学作用及ev相关疾病生物标志物的发现至关重要。目前，已开发出多种ev分离方法，主要包括超速离心(ultracentrifugation,uc)法、聚合物沉淀法、超滤法、免疫亲和捕获法、微流控技术和尺寸排阻层析(size-exclusionchromatography,sec)法等。但这些方法获取的ev产物均仍混有相当数量的游离蛋白质污染物，载脂蛋白b(apolipoprotein b,apob)是其中丰度最高的几种污染物之一。apob是低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,ldl)、中密度脂蛋白(intermediate-densitylipoprotein,idl)、极
3、早年研究显示肝素(heparin)与apob有较强的结合能力(weisgraber&rall,1987)，具亲和结合并去除ev分离产物中apob，从而提高ev纯度的潜力。然而也有文献报道认为肝素修饰的微球可作为亲和富集ev的介质(balaj等,2015)。本专利技术依据ev领域最新专家共识(théry等,2018)的标准，利用实验证明肝素偶联微球主要结合标本中的游离载脂蛋白颗粒，而未见明显的ev富集能力，可有效提高ev分离产物的纯度。
4、在此基础上，本专利技术进一步将上述肝素微球与guo等建立的简便ev分离技术——二分式sec法(dichotomic sec,dsec)(guo等,2021)结合，创造了具apob高效去除能力的改性sec柱，与配套的高纯度ev分离方法。并以血浆/血清这一最为复杂的人类体液为例，证明通过该方法可通过简单的一次洗脱获取高纯度ev。
5、综上，本专利技术证明使用肝素修饰的琼脂糖微球可从复杂体液获取的ev产物中亲和去除apob污染物，从而提高ev产物的纯度；而添加该微球的dsec法可快速从复杂体液标本中获取高纯度ev。
6、1.arraud,n.,linares,r.,tan,s.,gounou,c.,pasquet,j.-m.,mornet,s.,&brisson,a.r.(2014).extracellular vesicles from blood plasma:determination oftheir morphology,size,phenotype and concentration.journal of thrombosis andhaemostasis,12(5),614–627.https://doi.org/10.1111/jth.12554.
7、2.balaj,l.,atai,n.a.,chen,w.,mu,d.,tannous,b.a.,breakefield,x.o.,skog,j.,&maguire,c.a.(2015).heparin affinity purification of extracellularvesicles.scientific reports,5(1),10266.https://doi.org/10.1038/srep10266.
8、3.guo,j.,wu,c.,lin,x.,zhou,j.,zhang,j.,zheng,w.,wang,t.,&cui,y.(2021).establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatographyfor isolating extracellular vesicles toward clinical applications.journal ofextracellular vesicles,10(11),e12145.https://doi.org/10.1002/jev2.12145.
9、4.kalra,h.,drummen,g.p.c.,&mathivanan,s.(2016).focus on extracellularvesicles:introducing the next small big thing.international journal ofmolecular sciences,17(2),article 2.https://doi.org/10.3390/ijms17020170.
10、5.simonsen,j.b.(2017).what are we looking at？extracellular vesicles,lipoproteins,or both？circulation research,121(8),920–922.https://doi.org/10.1161/circresaha.117.311767.
11、6.théry,c.,witwer,k.w.,aikawa,e.,alcaraz,m.j.,anderson,j.d.,andriantsitohaina,r.,antoniou,a.,arab,t.,archer,f.,atkin-smith,g.k.,ayre,d.c.,bach,j.-m.,bachurski,d.,baharvand,h.,balaj,l.,baldacchino,s.,bauer,n.n.,baxter,a.a.,bebawy,m.,…zuba-surma,e.k.(2018).minimal information for studiesof extracellular vesicles 2018(misev2018):a position statement of 本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种提高细胞外囊泡纯度的方法，包括使用肝素偶联微球吸附待制备细胞外囊泡的样本中的非细胞外囊泡污染物；优选地，所述非细胞外囊泡污染物包括蛋白质；优选地，所述蛋白质包括载脂蛋白；优选地，所述载脂蛋白包括载脂蛋白B。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括将肝素偶联微球与从样本中提取的细胞外囊泡混合孵育，吸附细胞外囊泡中的非细胞外囊泡污染物。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括将所述肝素偶联微球添加至固定相填料中制备亲和层析柱，吸附待制备细胞外囊泡的样本中的非细胞外囊泡污染物。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤包括：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述缓冲体系包括PBS、HEPES或Tris-HCl；所述缓冲体系经0.15～0.45μm滤膜过滤；优选地，步骤S11中所述的浓缩为浓缩至原体积的1～10/100；优选地，所述超滤管的截留分子量为10～50kDa。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S13中溶液A与微球B的体积比为1:0.5～
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤包括：
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤S31所述混合填料包括肝素偶联微球和固定性填料；优选地，所述肝素偶联微球和固定性填料混合时的体积比为1～5：22.5～26.5；优选地，所述洗脱用流动相体积为层析柱柱床总体积的(1～3)/5；优选地，步骤S33所述超滤浓缩的截留分子量为10～50kDa；优选地，步骤S33所述超滤浓缩为浓缩至原体积的1～5/100。
9.根据权利要求1～8任一项所述的方法，其特征在于，所述微球选自琼脂糖微球、葡聚糖微球、多空纤维素微球中的至少一种；优选地，所述微球的直径为45～165μm；优选地，所述微球为琼脂糖微球；优选地，所述琼脂糖微球中琼脂糖浓度为2～6％(m/v)。
10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述从样本中提取的细胞外囊泡包括通过尺寸排阻层析、超速离心、聚合物沉淀、超滤、免疫亲和捕获和微流控中的至少一种方法制备；优选地，所述尺寸排阻层析包括二分式尺寸排阻层析。
...【技术特征摘要】
1.一种提高细胞外囊泡纯度的方法，包括使用肝素偶联微球吸附待制备细胞外囊泡的样本中的非细胞外囊泡污染物；优选地，所述非细胞外囊泡污染物包括蛋白质；优选地，所述蛋白质包括载脂蛋白；优选地，所述载脂蛋白包括载脂蛋白b。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括将肝素偶联微球与从样本中提取的细胞外囊泡混合孵育，吸附细胞外囊泡中的非细胞外囊泡污染物。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括将所述肝素偶联微球添加至固定相填料中制备亲和层析柱，吸附待制备细胞外囊泡的样本中的非细胞外囊泡污染物。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤包括：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述缓冲体系包括pbs、hepes或tris-hcl；所述缓冲体系经0.15～0.45μm滤膜过滤；优选地，步骤s11中所述的浓缩为浓缩至原体积的1～10/100；优选地，所述超滤管的截留分子量为10～50kda。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤s13中溶液a与微球b的体积比为1:0.5～1.5；优选地，所述溶液a与微球b的混合条件包括：4～25℃...
【专利技术属性】
技术研发人员：崔毅峙，郭嘉慧，王通，张嘉仪，肖旭煌，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：
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