一种基于非标记荧光染料和核酸适配体的Cr6+检测方法技术

技术编号：40608949 阅读：3 留言：0更新日期：2024-03-12 22:16

本发明专利技术属于化学物质检测技术领域，涉及一种基于非标记荧光染料SYBR Green I和核酸适配体的快速荧光法检测Cr<supgt;6+</supgt;：具体公开了一种特异性识别Cr<supgt;6+</supgt;的核酸适配体、Cr<supgt;6+</supgt;检测用生物化学传感器及Cr<supgt;6+</supgt;检测方法。当Cr<supgt;6+</supgt;核酸适配体与SYBR Green I染料共孵育时，SYBR Green I染料插入Cr<supgt;6+</supgt;适配体所形成的双链结构中，经495nm波长激发后在526nm发射波长处产生高强度荧光。当向孵育体系中加入Cr<supgt;6+</supgt;时，Cr<supgt;6+</supgt;与核酸适配体结合改变适配体结构，导致其双链结构打开且SYBR Green I染料无法插入适配体双链结构中，产生的荧光信号强度下降。因此，可通过测定荧光强度的衰减△F来指示待测溶液中Cr<supgt;6+</supgt;的含量。与现有技术相比，本发明专利技术检测方法检测限低、灵敏度高、特异性强，提供的检测方法可用于检测Cr<supgt;6+</supgt;的含量，检测的浓度范围是60‑300nmol/L。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及化学物质检测，特别是涉及一种基于非标记荧光染料和核酸适配体的cr6+检测方法及其应用。

技术介绍

1、铬被公认为人体不可缺少的八种微量元素之一，对维持生物体的正常生理功能至关重要。铬通常以cr3+和cr6+两种形式存在，在一定条件下两者价态之间可以相互转换。cr3+相对无毒，是一种必需的微量元素，可以有效调节血糖，对高胆固醇引起的心血管疾病有很好的预防作用。此外，铬在工业上应用广泛，在冶金、电镀、制革以及纺织染色等行业发挥着不可或缺的作用。然而，工业生产、矿山开采、冶炼过程以及废水处理不当等因素导致了铬离子的大量释放和累积，进一步造成土壤及地下水污染。由于其污染具有富积性和不可逆性，因此随着食物链的积累和浓缩，最终进入人体并对人体健康造成严重损害。cr6+是铬元素最具毒性的形态，并易被人体吸收且在人体内富积。暴露于高浓度的cr6+会对皮肤、黏膜和消化道等产生较强的刺激和腐蚀性，接触、误食都会对人体造成极大的伤害，进而导致多种健康疾病，可引起过敏性皮炎、支气管炎、腹部不适及腹泻等症状，严重者可导致皮肤充血、糜烂、溃疡等。随着体内的积聚，可能还会对肺、肾、肝等器官造成严重威胁。cr6+被世界卫生组织和国际癌症研究机构列为一级致癌物质，与肺癌、鼻咽癌和胃癌等多种癌症有关。近年来，我国各地发生过食品中铬超标事件，包括水果、面粉、食用油等。因此，寻找一种能够快速、灵敏、选择性地检测铬离子方法来保障消费者的健康，是非常必要和可取的。

2、为了准确检测cr6+浓度，多种有效的cr6+分析检测方法被广泛应用，主要包括传

技术实现思路

1、针对现有技术中cro42-检测技术的缺陷，本专利技术提供了一种基于非标记荧光染料sybr greeni和核酸适配体的快速荧光法检测cr6+，具体包括以下步骤。

2、1)准备cro42-核酸适配体，所述cro42-核酸适配体核苷酸序列如seq id no.1所示。

3、seq id no.1：

4、5’-attggcactccacgcatagggtcaagccgaaccgattgatcctatgctgtggtgtggttacctatgcgtgctaccgtga a-3’。

5、2)在所述cro42-核酸适配体溶液中加入cro42-溶液，混匀后进行第一次孵育；

6、3)向第一次孵育后的混合液中加入sybrgreeni溶液，使得所述sybrgreeni荧光染料嵌入cro42-核酸适配体所形成的双链当中，混匀后进行第二次孵育，在激发波长495nm和发射波长526nm处测定荧光强度f，并以不加待测cro42-的水溶液作为对照组，测定荧光强度f0，依据荧光强度计算待测溶液荧光强度差值△f＝f0-f；

7、4)基于拟合得到的直线方程，以及待测溶液对应的荧光强度的衰减△f，得到待测溶液中cro42-的含量。

8、本专利技术选用的核酸适配体具有良好的亲和力，其kd值为4.42μm。

9、本专利技术惊奇的发现当适配体是cro42-核酸适配体核苷酸序列时，与cro42-特异性结合好，灵敏度高。

10、在本专利技术的一个实施方式中，步骤2)中所述缓冲液为ph＝7.4的tris-ac缓冲液，浓度为10mm。

11、在本专利技术的一个实施方式中，步骤2)中核酸适配体与cro42-的孵育时间为30min，步骤3)中sybrgreeni的孵育时间为10min。

12、在本专利技术的一个实施方式中，步骤2)和3)中的反应温度为25℃。

13、在本专利技术的一个实施方式中，在检测体系中对加入sybrgreeni，cro42-核酸适配体的终浓度及sybrgreeni与cro42-核酸适配体作用的时间进行梯度优化后得到最优的检测条件：核酸适配体最优终浓度为200nm，sybrgreeni最优终浓度为1.0x，sybrgreeni与cro42-核酸适配体最优作用的时间为10min。

14、在本专利技术的一个实施方式中，线性拟合直线方程为y＝10.935x+221.255,线性方程中x代表检测样本中cro42-的浓度，nm，y代表样本荧光强度的差值△f。

15、本专利技术的原理(图3)是cro42-核酸适配体缓冲液中加入sybrgreeni溶液时，使得sybr greeni荧光染料插入特定的cro42-核酸适配体所形成的双链结构当中，在激发波长495nm和发射波长526nm处产生高强度的荧光。若此时体系中事先存在cro42-时，核酸适配体优先与cro42-结合导致其结构发生改变，双链结构打开且sybrgreeni荧光染料无法完全嵌入核酸适配体中，因此荧光信号强度降低，通过测定荧光强度的差值△f来判断待测溶液中cro42-的含量。

16、有益效果

17、本专利技术提供的检测方法不需要大型仪器设备、操作简单、灵敏度高、选择性好、成本低且高效，cro42-的检测范围为60-300nm，线性拟合直线方程为y＝10.935x+221.255，最低检测限为44.31nm。方法用于测定cro42-。线性方程中x代表检测样本中cro42-的浓度，nm，y代表样本荧光强度的差值△f。

18、为使本专利技术的上述目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附附图，作详细说明如下。

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【技术保护点】

1.一种基于非标记荧光染料和核酸适配体的Cr6+检测方法，其特征在于包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述一种基于非标记荧光染料和核酸适配体的Cr6+检测方法，其特征在于，所述缓冲液为Tris-Ac缓冲液。

3.根据权利要求1所述一种基于非标记荧光染料和核酸适配体的Cr6+检测方法，其特征在于，所述非标记荧光染料为SYBR Green I。

4.根据权利要求1所述一种基于非标记荧光染料和核酸适配体的Cr6+检测方法，其特征在于，所述核酸适配体与CrO42-的孵育时间30min，反应温度为25℃，反应体系与SYBR GreenI荧光染料的孵育时间为10min。

5.根据权利要求1所述一种基于非标记荧光染料和核酸适配体的Cr6+检测方法，其特征在于，所述核苷酸序列为SEQ ID No.1，所述SEQ ID No.1为5’-ATTGGCACTCCACGCATAGGGTCAAGCCGAACCGATTGATCCTATGCTGTGGTGTGGTTACCTATGCGTGCTACCGTGA A-3’。

6.根据权利要求1所述一种基于非标

7.根据权利要求1所述一种基于非标记荧光染料和核酸适配体的Cr6+检测方法，其特征在于，所述荧光探针的激发波长为495nm，发射波长为526nm。

8.根据权利要求1所述一种基于非标记荧光染料和核酸适配体的Cr6+检测方法，其特征在于，线性拟合直线方程为y＝10.935x+221.255,线性方程中x代表检测样本中CrO42-的浓度，nM，y代表样本荧光强度的差值△F。

9.根据权利要求2所述一种基于非标记荧光染料和核酸适配体的Cr6+检测方法，其特征在于，所述缓冲液的pH为7.4，浓度为10mM。

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【技术特征摘要】

1.一种基于非标记荧光染料和核酸适配体的cr6+检测方法，其特征在于包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述一种基于非标记荧光染料和核酸适配体的cr6+检测方法，其特征在于，所述缓冲液为tris-ac缓冲液。

3.根据权利要求1所述一种基于非标记荧光染料和核酸适配体的cr6+检测方法，其特征在于，所述非标记荧光染料为sybr green i。

4.根据权利要求1所述一种基于非标记荧光染料和核酸适配体的cr6+检测方法，其特征在于，所述核酸适配体与cro42-的孵育时间30min，反应温度为25℃，反应体系与sybr greeni荧光染料的孵育时间为10min。

5.根据权利要求1所述一种基于非标记荧光染料和核酸适配体的cr6+检测方法，其特征在于，所述核苷酸序列为seq id no.1，所述seq id no.1为5’-attggcactccacgcataggg...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓云，朱将雄，沈国清，俞红，王鲁梅，王丹凤，耿雪青，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：

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