【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测，具体涉及预测肺腺癌免疫治疗不良反应的circrna标记物及预测试剂盒。
技术介绍
1、随着肿瘤学和免疫学的不断探索和发展，肿瘤免疫治疗取得了非常多的成果，并且有多款免疫检查点抑制剂(pd1/pd-l1)获批，给诸多患者提供了许多疗效较好的药物，如k药(keytruda)、o药(opdivo)和i药(imfinzi)等。涉及的可用药癌症也有多种，黑色素瘤、非小细胞肺腺癌、头颈部鳞癌、胃癌、宫颈癌等。
2、癌症患者的适应症符合用药的前提下，患者在用药后缓解癌症进展的同时，还有一部分癌症患者由于自身免疫系统的原因，产生一些免疫不良反应(immune-relatedadverse events，iraes)。免疫相关不良反应是由调节t细胞活性所导致的免疫激活，可引起免疫相关的不良反应，从而引起相应器官的相关症状。免疫不良反应的症状也有多种多样，如免疫相关肺炎(咳嗽、胸痛等)、神经系统损坏、胃肠道反应(免疫相关肠炎)、内分泌功能失调(甲亢、甲状腺功能低下)等症状。免疫不良反应有轻症，也有重症，如果发生了严重的免疫不良反应，如相关肺炎、脑炎等可能会危及患者生命。所以癌症患者在使用免疫治疗药物后，如果可以及时的预测免疫不良反应的可能性或在患者发生免疫不良反应的早期就可以及时发现，对患者的疾病控制和后续诊疗方案调整都有重大的临床价值。
3、所以如何寻找可以及时预测免疫不良反应或是在早期免疫不良反应发生时就能够及时发现的生物标记物是非常有研究价值的课题。另外对应检测生物标记物的生物样本也尽量无创、对
4、在诸多前人研究成果中发现存在于尿液、血液等体液中自由流动的微小囊泡物质外泌体(exosome)内存在着非常丰富的内容物，包括膜蛋白、膜内蛋白、dna、mrna、lncrna、circrna等。外泌体作为细胞与细胞之间沟通的连接物质，参与了众多的生物学过程，包括炎症反应、调控因子转移等，在肿瘤的发生发展过程中也有重要的生物学功能，其中外泌体中的许多rna与肿瘤也有密切的关系。
5、环状rna(circrna)是一类特殊的非编码rna分子(在活体中有时也有表达)，与传统的线性rna(linear rna，含5’和3’末端)不同，circrna分子呈封闭环状结构，不受rna外切酶影响，表达更稳定，不易降解。在功能上，近年的研究表明，circrna分子富含microrna(mirna)结合位点，在细胞中起到mirna海绵(mirna sponge)的作用，通过与疾病关联的mirna相互作用，circrna在疾病中发挥着重要的调控作用。比如外泌体中circrna000-1445可作为mirna-127-5p的海绵，通过影响mirna-127-5p/snx5信号通路促进胶质瘤的增殖、迁移和侵袭。
6、本专利技术以血浆外泌体作为研究对象，利用ngs(next-generation sequencingtechnology)技术对外泌体内circrna进行测序和分析，探索其中可能的可以预测和早期检测免疫不良反应的生物标记物。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是，提供一种肺腺癌免疫治疗不良反应的circrna标记物以及预测试剂盒。
2、本专利技术为实现上述目的所采用的技术方案如下：
3、本专利技术提供的预测肺腺癌免疫治疗不良反应的circrna标记物为：cnot6l、cpsf6、abcc4、ro60、lclat1、pak2基因中的一种或它们的任何组合。
4、作为优选实施方案，所述免疫治疗不良反应为pd-1抑制剂或pd-1抑制剂联合用药治疗引起的免疫相关不良反应。所述免疫治疗采用的pd-1抑制剂主要为特瑞普利单抗、卡瑞利珠单抗。pd-1抑制剂联合化疗治疗的方式为：pd-1抑制剂联合培美曲赛、白蛋白结合紫杉醇等联合治疗。免疫不良反应包括肺炎、心肌炎、神经炎或脑炎等。
5、本专利技术还提供一种肺腺癌免疫治疗不良反应的预测试剂盒，该试剂盒包括：检测所述circrna标记物的表达水平的试剂。
6、作为优选实施方案，检测所述circrna标记物的引物为以下至少其一的引物对：
7、检测cnot6l基因的引物对为seq id no:4所示的上游引物和seq id no:5所示的下游引物；
8、检测cpsf6基因的引物对为seq id no:6所示的上游引物和seq id no:7所示的下游引物；
9、检测abcc4基因的引物对为seq id no:8所示的上游引物和seq id no:9所示的下游引物；
10、检测ro60基因的引物对为seq id no:10所示的上游引物和seq id no:11所示的下游引物；
11、检测lclat1基因的引物对为seq id no:12所示的上游引物和seq id no:13所示的下游引物；
12、检测pak2基因的引物对为seq id no:14所示的上游引物和seq id no:15所示的下游引物。
13、作为优选实施方案，所述试剂盒还包括检测内参基因的试剂，所述内参基因为gapdh和/或actb。
14、作为优选实施方案，检测所述内参基因的引物为以下至少其一的引物对：
15、检测gapdh基因的引物对为seq id no:16所示的上游引物和seq id no:17所示的下游引物；
16、检测actb基因的引物对为seq id no:18所示的上游引物和seq id no:19所示的下游引物。
17、本专利技术还提供所述试剂盒预测肺腺癌免疫治疗不良反应的方法，包括如下步骤：
18、步骤1，将待测样本进行血浆外泌体微量rna抽提；
19、步骤2，对抽提的外泌体总rna进行逆转录，逆转录体系采用的基因扩增引物池包括：t7启动子序列、通用序列、标签序列和用于检测cnot6l、cpsf6、abcc4、ro60、lclat1、pak2其中至少一种基因的引物；
20、步骤3，将逆转录产物cdna进行转录反应，得到的转录产物再进行逆转录及第一pcr反应，逆转录和第一pcr反应于同一体系内进行；该逆转录和第一pcr反应采用的基因扩增引物与步骤2相同；
21、步骤4，将第一pcr反应的产物进行纯化，纯化产物采用带有udi的通用引物进行第二pcr反应；由于第一pcr反应中采用的基因扩增引物池包含通用序列，因此第二pcr反应可以直接采用通用序列中的任意部分序列作为通用引物进行扩增。
22、步骤5，将第二pcr反应的产物进行纯化，得到纯化的文库；然后上机进行分析和结果解读。
23、作为优选实施方案，所述步骤2中基因扩增引物池的正向引物为：t7启动子序列+正向通用序列+正向标签序列+靶向基因上游引物，反向引物为：反向通用序列+反向标签序列+靶向基因下游本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.预测肺腺癌免疫治疗不良反应的circRNA标记物，其特征在于：所述标记物为CNOT6L、CPSF6、ABCC4、RO60、LCLAT1、PAK2基因中的一种或它们的任何组合。
2.根据权利要求1所述的预测肺腺癌免疫治疗不良反应的circRNA标记物，其特征在于：所述免疫治疗不良反应为PD-1抑制剂或PD-1抑制剂联合用药治疗引起的免疫相关不良反应。
3.一种肺腺癌免疫治疗不良反应的预测试剂盒，其特征在于，所述预测试剂盒包括：检测权利要求1所述circRNA标记物的表达水平的试剂。
4.根据权利要求3所述的肺腺癌免疫治疗不良反应的预测试剂盒，其特征在于，检测所述circRNA标记物的引物为以下至少其一的引物对：
5.根据权利要求3所述的肺腺癌免疫治疗不良反应的预测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测内参基因的试剂，所述内参基因为GAPDH和/或ACTB。
6.根据权利要求5所述的肺腺癌免疫治疗不良反应的预测试剂盒，其特征在于，检测所述内参基因的引物为以下至少其一的引物对：
7.权利要求3所述的试剂盒预测
8.根据权利要求7所述的预测肺腺癌免疫治疗不良反应的方法，其特征在于，所述步骤2基因扩增引物池中的正向引物为：T7启动子序列+正向通用序列+正向标签序列+靶向基因上游引物，反向引物为：反向通用序列+反向标签序列+靶向基因下游引物；其中，T7启动子序列如SEQ ID NO:1所示；正向通用序列如SEQ ID NO:2所示，正向标签序列为NNNNN(N)-s-T，(N)-s-表示该碱基为硫代修饰；反向通用序列如SEQ ID NO:3所示，反向标签序列为NNNNN(N)-p，(N)-p-表示该碱基为磷酸化修饰。
9.根据权利要求7所述的预测肺腺癌免疫治疗不良反应的方法，其特征在于，所述步骤2中的逆转录体系为：外泌体RNA，逆转录酶180-250U，逆转录缓冲液，dNTP 0.1-1mM，基因扩增引物池；所述引物池中的每条引物在转录体系中的浓度为0.05-0.5μM，引物池包括：检测CNOT6L、CPSF6、ABCC4、RO60、LCLAT1、PAK2其中至少一种靶向基因的引物和检测GAPDH、ACTB其中至少一种内参基因的引物。
10.根据权利要求7所述的预测肺腺癌免疫治疗不良反应的方法，其特征在于，所述步骤3中转录反应体系为：T7 RNA聚合酶140U-240U，转录缓冲液，ATP 1-3mM，GTP 1-3mM，CTP1-3mM，UTP 1-3mM。
11.根据权利要求7所述的预测肺腺癌免疫治疗不良反应的方法，其特征在于，所述步骤3中逆转录和第一PCR反应的体系为：M-MLV逆转录酶、热稳定无机焦磷酸酶、taq酶、taq酶缓冲液、基因扩增引物池；所述基因扩增引物池中的引物及浓度与步骤2的引物池相同。
12.根据权利要求7所述的预测肺腺癌免疫治疗不良反应的方法，其特征在于，所述步骤4中第一PCR反应的产物和步骤5中的第二PCR反应的产物均采用Ampure XP磁珠进行纯化。
13.根据权利要求7所述的预测肺腺癌免疫治疗不良反应的方法，其特征在于，所述步骤4中第二PCR反应的体系为：taq酶、taq酶缓冲液、带有UDI的通用引物。
...【技术特征摘要】
1.预测肺腺癌免疫治疗不良反应的circrna标记物，其特征在于：所述标记物为cnot6l、cpsf6、abcc4、ro60、lclat1、pak2基因中的一种或它们的任何组合。
2.根据权利要求1所述的预测肺腺癌免疫治疗不良反应的circrna标记物，其特征在于：所述免疫治疗不良反应为pd-1抑制剂或pd-1抑制剂联合用药治疗引起的免疫相关不良反应。
3.一种肺腺癌免疫治疗不良反应的预测试剂盒，其特征在于，所述预测试剂盒包括：检测权利要求1所述circrna标记物的表达水平的试剂。
4.根据权利要求3所述的肺腺癌免疫治疗不良反应的预测试剂盒，其特征在于，检测所述circrna标记物的引物为以下至少其一的引物对：
5.根据权利要求3所述的肺腺癌免疫治疗不良反应的预测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测内参基因的试剂，所述内参基因为gapdh和/或actb。
6.根据权利要求5所述的肺腺癌免疫治疗不良反应的预测试剂盒，其特征在于，检测所述内参基因的引物为以下至少其一的引物对：
7.权利要求3所述的试剂盒预测肺腺癌免疫治疗不良反应的方法，其特征在于，包括如下步骤：
8.根据权利要求7所述的预测肺腺癌免疫治疗不良反应的方法，其特征在于，所述步骤2基因扩增引物池中的正向引物为：t7启动子序列+正向通用序列+正向标签序列+靶向基因上游引物，反向引物为：反向通用序列+反向标签序列+靶向基因下游引物；其中，t7启动子序列如seq id no:1所示；正向通用序列如seq id no:2所示，正向标签序列为nnnnn(n)-s-t，(n)-s-表...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵小玉，马跃，臧远胜，焦晓栋，张亚楠，
申请(专利权)人：上海思路迪生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。