【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞与基因治疗相关，具体为人类基因组基因安全座的生物信息学预测和下游筛选方法。
技术介绍
1、人类基因组中的基因安全座(genomic safe harbor)是基因组中的一些特殊区域，在进化过程中保持相对稳定，对维持基因组的稳定性和功能至关重要。主要有如下功能：(1)维持基因组稳定性：基因安全座往往位于基因组中较稳定的区域，它们相对较少受到突变和结构变化的影响。这些区域的存在可以防止异常的基因重组和插入/删除事件等，有助于维持基因组的结构稳定性。(2)避免不利后果的突变：基因安全座通常富含保守序列，这些序列在物种之间具有高度保守性。通过保持这些区域的稳定性，基因安全座有助于避免可能导致不利后果的突变事件，例如功能丧失、疾病风险增加等。
2、基因安全座这一概念近年来也在细胞与基因治疗领域逐渐得到关注与重视。通过基因安全座可以达到如下效果：(1)定位治疗靶点：基因安全座可以帮助确定适合进行基因治疗的目标区域。由于基因安全座通常位于相对稳定的基因组区域，选择这些区域作为治疗靶点可以增加基因治疗的效果和稳定性。(2)保护基因表达：基因安全座中的基因通常在生理上起着重要的作用，使用这些基因作为治疗目标可以确保正确的基因表达。此外，基因安全座中的调控元件和表观遗传修饰可以提供正常的基因表达环境，有助于维持长期的治疗效果。(3)避免不必要的副作用：基因安全座通常避免了基因组中可变性较高的区域，这些区域可能导致副作用或意外的基因重组。选择基因安全座作为治疗靶点可以降低治疗过程中不必要的副作用和意外事件的发生。(4)增
3、综上所述人类基因组中的基因安全座对基因治疗具有重要影响。通过选择基因安全座作为治疗靶点，可以提高基因治疗的效果、稳定性和持久性，同时降低不必要的副作用和意外事件的发生。基因安全座还有助于个性化治疗策略的开发，提供更精准的基因治疗方案。
4、当前关于人类基因安全座的定义与标准已经有了初步的共识，例如与转录单位没有重叠部分；远离任何基因的5'端；远离癌症相关基因；远离microrna；远离基因组中心体、端粒等保守元件。但是该共识内的涉及范围是否全面还有待进一步论证。表观遗传学是近年来的又一研究热点，它作为基因表达调控的机制，在不涉及dna序列的改变情况下，通过化学修饰(如dna甲基化和组蛋白修饰)或rna干扰等方式，影响基因的活性和表达，因此可推断表观遗传在于细胞与基因治疗领域也发挥着一定的作用，然而目前表观遗传在基因安全座内的作用尚无相关报告，因此需要进一步的相关验证。
5、有了关于人类基因安全座的定义与标准，下一步就需要去挖掘与筛选这些基因安全座位点，目前的研究主要通过某些湿实验发现了一些基因安全座位点，亦或是通过生信算法预测罗列了部分安全座位点，没有体系化的将生信预测与湿实验验证结合，体系化的筛选与评估这些位点。目前没有系统筛选和评估人类基因安全座的方法，特别是从生信预测与实验验证相关结合的系统化评估；而现有的人类基因安全座的定义和判断标准不够完善，需要补充完善；验证人类基因安全座的评估需要系统从多角度评估在基因安全座插入后对细胞近远期的影响。
技术实现思路
1、为解决现有技术存在目前没有系统筛选和评估人类基因安全座的方法，特别是从生信预测与实验验证相关结合的系统化评估；而现有的人类基因安全座的定义和判断标准不够完善，需要补充完善；验证人类基因安全座的评估需要系统从多角度评估在基因安全座插入后对细胞近远期的影响的缺陷，本专利技术提供人类基因组基因安全座的生物信息学预测和下游筛选方法。
2、为了解决上述技术问题，本专利技术提供了如下的技术方案：
3、本专利技术人类基因组基因安全座的生物信息学预测和下游筛选方法，包括以下步骤，
4、步骤1、对基因安装座调研，明确基因安全座的定义；
5、步骤2、获取公开可用的人类基因组数据；进行初始的基因预测和注释，然后根据基因安全座定义在人类基因组上进行截取归纳成人类基因安全座位集合。
6、步骤3、通过生物信息学进行插入脱靶预测，然后进行打分排序，挑选在靶评分高、脱靶概率低的前5位点进行后续验证；
7、步骤4、根据检测结果，最终确定经生信预测以及实验验证的人类基因安全座集合。
8、作为本专利技术的一种优选技术方案，所述步骤3的具体操作是，通过crispr/cas9技术在上一步选取的5个基因安全座上敲入目的片段，长时间培养敲入后的细胞，并进行系列性的检测；
9、通过qpcr检测在1、3、6个月后敲入目的片段后的表达情况，检测目的片段的基因的表达稳定性。
10、作为本专利技术的一种优选技术方案，所述步骤3中还包括进行整合安全性评估；针对不同时间段下的插入事件进行脱靶检测。靶向插入后理论上细胞是单克隆状态，但是现实情况下可能存在多克隆状态，因此需要进行优势克隆的评估，检测随着时间变化细胞克隆状态的变化。插入后致癌风险是当下关注的重点问题，因此针对现有的癌基因及其相关基因进行表达检测，排除长时间下发生癌变的可能。
11、作为本专利技术的一种优选技术方案，所述对基因安装座调研，明确基因安全座的定义的方法是，通过pubmed、谷歌学术以及万方、知网、维普等文献数据库检索与调研国内外关于基因安全座(gsh)相关的研究、综述，搜集整理关于ghs的相关定义，从多个相关领域内的研究明确人类基因组中安全座的定义。
12、作为本专利技术的一种优选技术方案，所述的公开可用的人类基因组数据为ncbi的genbank数据库、ucsc genome browser或ensembl数据库中的一种或多种。。
13、作为本专利技术的一种优选技术方案，所述并进行系列性的检测的操作是目的片段的表达效率。
14、本专利技术的有益效果是：
15、该种人类基因组基因安全座的生物信息学预测和下游筛选方法。而本方法提供了一个从生物信息学预测、分析，到湿实验验证的体系化验证基因安全座的评估流程，最终也提供了3个可以直接在后续研究/生产环境使用的人类基因安全座集合；既往对于基因安全座只是通过生信预测或单纯湿实验发现基因安全座,比较单一片面。
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1.人类基因组基因安全座的生物信息学预测和下游筛选方法，其特征在于：包括以下步骤，
2.根据权利要求1所述的人类基因组基因安全座的生物信息学预测和下游筛选方法，其特征在于，所述步骤3的具体操作是，通过CRISPR/Cas9技术在上一步选取的5个基因安全座上敲入目的片段，长时间培养敲入后的细胞，并进行系列性的检测；
3.根据权利要求1所述的人类基因组基因安全座的生物信息学预测和下游筛选方法，其特征在于，所述步骤3中还包括进行整合安全性评估；所述的整合安全性评估包括针对不同时间段下的插入事件进行脱靶检测；进行优势克隆的评估，检测随着时间变化细胞克隆状态的变化；进行表达检测，排除长时间下发生癌变的可能。
4.根据权利要求1所述的人类基因组基因安全座的生物信息学预测和下游筛选方法，其特征在于，所述对基因安装座调研，明确基因安全座的定义的方法是，通过Pubmed、谷歌学术以及万方、知网、维普等文献数据库检索与调研国内外关于基因安全座（GSH）相关的研究、综述，搜集整理关于GHS的相关定义，从多个相关领域内的研究明确人类基因组中安全座的定义。
6.根据权利要求1所述的人类基因组基因安全座的生物信息学预测和下游筛选方法，其特征在于，所述的并进行系列性的检测的操作是目的片段的表达效率。
...【技术特征摘要】
1.人类基因组基因安全座的生物信息学预测和下游筛选方法，其特征在于：包括以下步骤，
2.根据权利要求1所述的人类基因组基因安全座的生物信息学预测和下游筛选方法，其特征在于，所述步骤3的具体操作是，通过crispr/cas9技术在上一步选取的5个基因安全座上敲入目的片段，长时间培养敲入后的细胞，并进行系列性的检测；
3.根据权利要求1所述的人类基因组基因安全座的生物信息学预测和下游筛选方法，其特征在于，所述步骤3中还包括进行整合安全性评估；所述的整合安全性评估包括针对不同时间段下的插入事件进行脱靶检测；进行优势克隆的评估，检测随着时间变化细胞克隆状态的变化；进行表达检测，排除长时间下发生癌变的可能。
4.根据权利要求1所述的人类基因组基因安全座的...
【专利技术属性】
技术研发人员：阚科佳，倪帅，冯日露，侯宇宸，吴宁，
申请(专利权)人：上海唯可生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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