【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种用于体外提取细胞线粒体的试剂盒和方法。
技术介绍
1、线粒体在过去三十年一直被视为医学的治疗靶点。靶向线粒体缺陷的研究非常丰富，提示其具有巨大的潜力。近年来，线粒体移植用于修复组织功能的引起了学界的极大兴趣。到目前为止，线粒体移植的应用范围已扩大到各种疾病模型，包括缺血再灌注损伤、神经退行性疾病、肾损伤、ards等。
2、体外线粒体提取制备是将线粒体移植应用于临床的第一步。体外线粒体提取制备的主要步骤分为：1)细胞裂解分离线粒体组分，2)线粒体纯化。其中，线粒体裂解方法主要包括：1)机械性裂解法，包括：研磨匀浆，即通过使用特定的研磨仪器(如dounce和potter-elvehjem匀浆器)使细胞和组织通过狭窄区域而导致其破碎释放细胞组分；超声裂解，即通过低频超声裂解细胞；2)化学裂解法，包括使用毛地黄皂苷或者肝素等，破坏细胞外膜结构，使其释放细胞组分。线粒体的纯化方法主要包括：1)差速离心，涉及至少两个具有不同离心速度的程序：低速离心旨在丢弃细胞核等大型细胞器，而高速离心则用于沉淀线粒体；2)密度梯度离心，即借助不连续密度梯度介质(如ficoll)，细胞裂解液中具有相同密度的颗粒将通过离心到达相同的密度层从而纯化线粒体；3)磁珠分选：使用磁性微珠作为亲和材料通过抗体结合捕获线粒体的方法。
3、提取后的线粒体需保存在相应的线粒体贮存液中，且需要尽快进行下一步操作，以防止线粒体的损伤。
4、对于线粒体移植，需要分离具有完整膜电位和atp产生能力的功能性线粒体。然而
5、目前市售线粒体提取及储存液试剂盒其内部配方成分未公布。根据文献报道，目前常用的线粒体储存也主要包括以下几种成分：渗透压调节溶液(如甘露醇、山梨糖醇、蔗糖)，离子缓冲液(如tris-hcl、hepes)以及钙离子螯合剂(如egta、edta)。然而，利用目前配方保存的线粒体在较短的时间内会丧失膜电位以及呼吸功能，且短时间内由于其复杂的成分无法用于临床。
技术实现思路
1、为了克服现有技术中的缺陷，本专利技术提供了一种用于体外提取细胞线粒体的试剂盒和方法。
2、为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、本专利技术的第一方面是提供一种用于体外提取细胞线粒体的试剂盒，其包括提取液a液、提取液b液、提取液c液和储存液；
4、其中，上述提取液a液包括edta、乳酸钠和氯化钠，上述提取液b液为肝素溶液，上述提取液c液包括甘露醇、edta、乳酸钠和氯化钠，上述储存液包括甘露醇、edta、乳酸钠、琥珀酸、丙酮酸钠和氯化钠。
5、进一步地，上述提取液a液由edta、乳酸钠和氯化钠制备而成，上述提取液c液由甘露醇、edta、乳酸钠和氯化钠制备而成，上述储存液由甘露醇、edta、乳酸钠、琥珀酸、丙酮酸钠和氯化钠制备而成。
6、进一步地，以含有100ml 0.6％氯化钠溶液计，上述提取液a液采用如下的方法制备：将60～90mg edta，200～450mg乳酸钠溶于100ml 0.6％氯化钠中，过滤制备成a液；优选将87.6mg edta，310mg乳酸钠溶于100ml 0.6％氯化钠溶液中，过滤制备成a液。
7、进一步地，上述肝素溶液的质量体积比为1～10％，优选为4％。
8、进一步地，以含有100ml 0.9％氯化钠溶液计，上述提取液c液采用如下的方法制备：将2～6g甘露醇，60～90mg edta，200～450mg乳酸钠溶于100ml 0.9％氯化钠溶液中，过滤制备成c液；优选将4.55g甘露醇，87.6mg edta，310mg乳酸钠溶于100ml 0.9％氯化钠溶液中，过滤制备成c液。
9、进一步地，以含有100ml 0.9％氯化钠溶液计，上述储存液采用如下的方法制备：将2～6g甘露醇，60～90mg edta，200～450mg乳酸钠，100～150mg琥珀酸，40～60mg丙酮酸钠溶于100ml 0.9％氯化钠溶液中，过滤制备成储存液；优选将4.55g甘露醇，87.6mg edta，310mg乳酸钠，135mg琥珀酸，55mg丙酮酸钠溶于100ml 0.9％氯化钠溶液中，过滤制备成储存液。
10、本专利技术的第二方面是提供采用上述试剂盒的体外提取细胞线粒体的方法，其包括如下步骤：
11、步骤一，将消化后的细胞加入提取液a液中，涡旋振荡后置于冰上；
12、步骤二，加入提取液b液，置于冰上，期间间隔涡旋振荡；
13、步骤三，加入提取液c液，混匀后离心，取上清，再离心，弃去上清，沉淀为线粒体；
14、步骤四，采用储存液重悬沉淀置于冰上备用。
15、进一步地，在步骤二中，置于冰上5min，每1分钟涡旋振荡5s。
16、进一步地，在步骤三中，离心的参数是700g，离心10min。
17、进一步地，在步骤三中，再离心的参数是10000g，离心15min。
18、本专利技术采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
19、本专利技术利用该提取液和储存液可更好地在体外维持线粒体的功能，延长了从线粒体提取到应用到患者身上的间隔时间，为临床上应用线粒体移植提供了有利帮助。
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1.一种用于体外提取细胞线粒体的试剂盒，其特征在于，包括提取液A液、提取液B液、提取液C液和储存液；
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述提取液A液由EDTA、乳酸钠和氯化钠制备而成，所述提取液C液由甘露醇、EDTA、乳酸钠和氯化钠制备而成，所述储存液由甘露醇、EDTA、乳酸钠、琥珀酸、丙酮酸钠和氯化钠制备而成。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，以含有100ml 0.6％氯化钠溶液计，所述提取液A液采用如下的方法制备：将60～90mg EDTA，200～450mg乳酸钠溶于100ml 0.6％氯化钠溶液中，过滤制备成A液；优选将87.6mg EDTA，310mg乳酸钠溶于100ml 0.6％氯化钠溶液中，过滤制备成A液。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述肝素溶液的质量体积比为1～10％，优选为4％。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，以含有100ml 0.9％氯化钠溶液计，所述提取液C液采用如下的方法制备：将2～6g甘露醇，60～90mg EDTA，200～450mg乳酸钠溶于100
6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，以含有100ml 0.9％氯化钠溶液计，所述储存液采用如下的方法制备：将2～6g甘露醇，60～90mg EDTA，200～450mg乳酸钠，100～150mg琥珀酸，40～60mg丙酮酸钠溶于100ml 0.9％氯化钠溶液中，过滤制备成储存液；优选将4.55g甘露醇，87.6mg EDTA，310mg乳酸钠，135mg琥珀酸，55mg丙酮酸钠溶于100ml 0.9％氯化钠溶液中，过滤制备成储存液。
7.采用如权利要求1～6任一项所述试剂盒的体外提取细胞线粒体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤二中，置于冰上5min，每1分钟涡旋振荡5s。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤三中，离心的参数是700g，离心10min。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤三中，再离心的参数是10000g，离心15min。
...【技术特征摘要】
1.一种用于体外提取细胞线粒体的试剂盒，其特征在于，包括提取液a液、提取液b液、提取液c液和储存液；
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述提取液a液由edta、乳酸钠和氯化钠制备而成，所述提取液c液由甘露醇、edta、乳酸钠和氯化钠制备而成，所述储存液由甘露醇、edta、乳酸钠、琥珀酸、丙酮酸钠和氯化钠制备而成。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，以含有100ml 0.6％氯化钠溶液计，所述提取液a液采用如下的方法制备：将60～90mg edta，200～450mg乳酸钠溶于100ml 0.6％氯化钠溶液中，过滤制备成a液；优选将87.6mg edta，310mg乳酸钠溶于100ml 0.6％氯化钠溶液中，过滤制备成a液。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述肝素溶液的质量体积比为1～10％，优选为4％。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，以含有100ml 0.9％氯化钠溶液计，所述提取液c液采用如下的方法制备：将2～6g甘露醇，60～90mg edta，200～450mg乳酸钠溶于100ml 0.9％氯化钠溶液中，过滤...
【专利技术属性】
技术研发人员：高俊杰，张长青，马一阳，
申请(专利权)人：上海市第六人民医院，
类型：发明
国别省市：
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