本发明专利技术公开了一种转化子，包括受体菌和转化到受体菌内部的重组载体，所述的受体菌为乳酸乳球菌ＮＺ９８００，重组载体的原始载体为ｐＮＺ８１１２，重组载体的外源目的基因包括鸡抑制素α亚基基因、霍乱毒素Ｂ亚基基因以及细胞壁锚定子Ｍ６基因。本发明专利技术转化子可以通过口服方式进入鸡肠道，与注射免疫相比，降低直接与循环系统接触引起的毒性，增加疫苗的安全性。选用抗原基因／免疫增强因子联合免疫，增强了机体免疫应答，提高了免疫效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程领域，尤其涉及一种口服免疫阻断鸡抑制素作用的转化子及其应用。
技术介绍
禽产品是人类主要动物性食品之一。随着人们生活水平的不断提高，市场对禽产品的需求日益增加。我国是个多禽种国家，地方鸡种资源十分丰富，我国的这些品种与国外培育出的一些“专用家禽品种”相比，具有对周围环境的高度适应性、耐粗放管理、抗病性强、肉及蛋的品质好等特点。然而由于地方鸡种产蛋量少、生长慢、饲料利用率低，再加上外来高生产性能品种的引进，使许多地方鸡种由于市场竞争而逐步减少甚至濒危或灭绝。外来品种虽然生长快、饲料利用率高，但肉及蛋的品质差。随着生活水平的提高，人们已越来越注重禽产品的品质，目前市场对高品质土鸡蛋及肉产品的需求量迅猛增长，这种转变给我们提出了培育产蛋率高、肉蛋品质好的新品种、品系的要求和挑战。提高动物繁殖性能一直是动物生产研究人员所努力的目标。但目前通过传统的遗传改良和营养调控手段来提高动物繁殖力已很难再有大的进展。因而研究一种安全、高效、对人类无毒副作用的提高动物繁殖性能的制剂或产品是目前养殖业所面临的迫切问题。动物的生产性状总是由促进和抑制两类激素或因子联合控制的。如果把免疫学的方法应用于动物繁殖性能的调控，选择对动物繁殖力有抑制作用的激素或因子作为抗原来免疫动物，可诱发机体产生对抗该种激素或因子的抗体，从而抑制或减弱该激素或因子的生理功能，进而提高动物的繁殖性能。该技术对那些繁殖性能差的地方品种意义尤其重大，且十分安全无任何副作用。由于大肠杆菌、酵母菌等不能在动物肠道中定植，所以不能进行口服免疫，必须将所表达的目的产物纯化进行注射免疫。蛋白纯化步骤大大增加了生产的成本和难度，使大规模生产目的蛋白制剂难以实现。同时注射免疫程序也较繁琐，不仅要耗费较大人力，对动物的应激和伤害也较大。因此迫切需要研制出一种对动物繁殖力起促进作用的安全、方便并能进行大规模生产的口服制剂。乳酸菌是一类在食品中应用最广泛的重要工业菌株，它包括乳酸乳球菌、乳酸杆菌等十几个属，被公认为是安全的食品级微生物。乳酸菌本身就是一种益生菌，能调节肠道微环境，帮助消化，抑制肠道有害微生物，防治腹泻，促动物生长增重。
技术实现思路
本专利技术提供了一种口服免疫阻断鸡抑制素作用的转化子，该转化子可以通过口服方式摄入并定植在鸡肠道内，其分泌的融合蛋白能有效诱发鸡体内产生抗鸡抑制素α亚基的抗体，从而抑制或减弱内源抑制素对鸡繁殖力的抑制作用。一种转化子，包括受体菌和转化到受体菌内部的重组载体，所述的受体菌为乳酸乳球菌NZ9800，重组载体的原始载体为pNZ8112，重组载体的外源目的基因包括鸡抑制素-->α亚基基因、霍乱毒素B亚基基因以及细胞壁锚定子M6基因。鸡抑制素(Inhibin，INH)主要是由性腺产生的一种二聚体糖蛋白，由一个α亚基和一个β亚基组成，其中α亚基是抑制素特有的亚基，β亚基在其它性腺糖蛋白激素如活化素中也存在。Inhibin抑制动物繁殖力的作用机理在于其对垂体卵泡刺激素(FSH)的负反馈调节，血浆FSH含量的降低导致卵泡的生长发育及精子的产生受阻，因而Inhibin是调节动物繁殖力的一个重要因子。理论上，阻断Inhibin对FSH的这种负反馈作用可引起FSH释放量增加，从而使排卵率和精子产量增加。在本专利技术中抑制素α亚基(GenBank号：NM_001031257)作为免疫原。为了增强机体免疫应答，提高免疫效果，在抗原基因上连接霍乱毒素B亚基基因，霍乱毒素B亚基(Cholera toxin B subunit，简称CTB，GenBank号：U25679)为免疫增强子，研究表明它是一种无毒性的非常有效的黏膜免疫佐剂，特别适合作为口服疫苗的免疫增强佐剂蛋白。细胞壁锚定子M6(GenBank号：M11338)可与乳酸乳球菌细胞膜上的蛋白相结合，免疫原和免疫增强子被表达后分泌到胞外，通过细胞壁锚定子M6能够固定在细胞壁上。原始载体pNZ8112含有强启动子即乳链菌肽A(Nisin A)的启动子NisA(GenBank号：AY303241)以及高效分泌型信号肽Usp45(GenBank号：M60178)，信号肽Usp45位于启动子NisA的下游，外源目的基因连接在信号肽的C端。所述的抑制素α亚基基因、霍乱毒素B亚基基因、细胞壁锚定子M6基因、启动子NisA和信号肽Usp45的碱基序列如SEQ ID NO.5～9所示。乳酸菌本身就是一种益生菌，能调节肠道微环境，帮助消化，抑制肠道有害微生物，防治腹泻，促动物生长增重。乳酸菌能在体内定植或短暂定植是它发挥生理功能的必要条件。通过载体把目的基因如免疫原基因导入乳酸菌中，然后制成活菌制剂饲喂，引入动物体内，产生外源目的基因的产物从而引起黏膜和体液免疫。经研究发现，在肠道中能较长时间定植的乳酸杆菌容易使动物对目的外源基因产物产生免疫耐受，而在肠道中短暂定植的乳酸乳球菌不产生这种免疫耐受现象。本专利技术还提供上述转化子在免疫阻断鸡抑制素作用中的应用，通过将分泌表达了外源目的基因产物的转化子喂食给鸡，乳酸乳球菌就会短暂定植在鸡肠道内，从而引起鸡对外源目的基因产物产生免疫，即对乳酸菌表达的抑制素α亚基产生免疫，产生抗抑制素α亚基的抗体，该抗体可减弱或抑制鸡内源抑制素对鸡繁殖性能的抑制作用，达到提高动物繁殖力的目的。根据上述应用，本专利技术又提供了一种利用上述转化子制备的鸡口服免疫制剂，它包括培养基和分泌了外源目的基因产物的转化子。该制剂制备和使用均十分方便。所述的培养基可以为能促进乳酸乳球菌生长的培养基，优选为GM17培养基。在使用时，上述口服免疫制剂中转化子浓度最好为1×108cfu/mL～1×1010cfu/mL，使得肠道内的乳酸乳球菌达到一定浓度，每次喂食量为2ml。本专利技术还提供了一种上述鸡口服免疫制剂的制备方法，包括以下步骤：将转化子置于培养基中，培养至OD600为0.3～0.5，加入乳链菌肽继续培养2～3h。所述的乳链菌肽为表达诱导物，加入后浓度优选为10～20ng/mL。本专利技术转化子可以通过口服方式进入鸡肠道，与注射免疫相比，降低直接与循环系统接触引起的毒性，增加疫苗的安全性。选用抗原基因/免疫增强因子(无毒性的霍乱-->毒素B亚基)联合免疫，增强了机体免疫应答，提高了免疫效果。具体实施方式GM17液体培养基：胰蛋白胨2％；酵母膏0.5％；Vc 0.05％；牛肉膏0.5％；乙酸钠0.15％；氯化钠0.4％；MgSO4.7H2O 0.25％；葡萄糖0.5％，调至pH 6.8。GM17固体培养基在上述培养基基础上添加1.6％的琼脂。乳酸乳球菌NZ9800和载体pNZ8112均为商业化产品，来自荷兰的NIZO food research。1、目的基因的构建及克隆表达(1)CTB基因成熟区的获得：上游引物CTB P1(SEQ ID NO.1)：5’-GGACACCTCAAAATATTACTG-3’引物结构为：保护碱基(GG)-Xba I位点(框中序列)-CTB 5’端部分序列(下划线序列)下游引物CTB P2(SEQ ID NO.2)：5’-TGATTTGCCATACTAATTG-3’引物结构：保护碱基(TG)-EcoR I位点(框中序列)-CTB 3’端部分序列(下划线)。用上述引物以霍乱弧菌本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种转化子，包括受体菌和转化到受体菌内部的重组载体，其特征在于：所述的受体菌为乳酸乳球菌ＮＺ９８００，重组载体的原始载体为ｐＮＺ８１１２，重组载体的外源目的基因包括鸡抑制素α亚基基因、霍乱毒素Ｂ亚基基因以及细胞壁锚定子Ｍ６基因。
【技术特征摘要】
1.一种转化子，包括受体菌和转化到受体菌内部的重组载体，其特征在于：所述的受体菌为乳酸乳球菌NZ9800，重组载体的原始载体为pNZ8112，重组载体的外源目的基因包括鸡抑制素α亚基基因、霍乱毒素B亚基基因以及细胞壁锚定子M6基因。2.权利要求1所述转化子在免疫阻断鸡内源抑制素作用中的应用。3.一种利用权利要求1所述转化子制备的鸡口服免疫制剂，其特征在于：包括培养基和分泌了所述外源目的基因产物的转化子。4.根据权利要求3所...
【专利技术属性】
技术研发人员：牛冬，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]
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