【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医药，具体涉及一种bcl6小分子荧光探针及其制备方法与应用。
技术介绍
1、b细胞淋巴因子6(bcl6)是体液免疫反应中重要的转录抑制因子，人bcl6基因约为24kb，编码95kd左右的bcl6蛋白。bcl6蛋白为poz/btb/zinc finger蛋白家族的一员，其主要由三部分构成：1)氨基端的poz/btb结构域——发挥转录抑制作用的主要功能区域，bcl6发挥转录抑制作用需要btb结构域自发形成二聚体，三个主要的转录共抑制因子smrt、bcor或ncor以竞争性结合的方式结合到btb结合位点，共同发挥转录抑制作用，参与生发中心(gc)形成早期的转录调控。2)中部区域(三个pest结构域，也称rd2结构域)，其主要招募mta3或ctbp1等辅因子，起到蛋白稳定的作用。3)羧基端的锌指结构域由6个相同的锌指结构组成，主要发挥结合dna的作用，是bcl6发挥转录抑制作用的前提条件。
2、bcl6是一种对gc发育和维持至关重要的转录抑制因子。在gc反应中，bcl6的染色体易位与点突变导致bcl6蛋白持续性的高表达，促使b细胞恶性增殖，进而导致b细胞淋巴瘤的发生。大多数b细胞非霍奇金淋巴瘤(b-nhl)来源于gc，其中弥漫大b细胞淋巴瘤(dlbcl)是最常见的亚型，bcl6被公认为是dlbcl的致癌驱动因子。许多临床前研究也表明，阻断bcl6-btb结构域与其转录共抑制因子之间的相互作用，能够抑制gc形成和dlbcl细胞增殖，是治疗dlbcl的有效策略，且安全性良好，不会引起毒副作用和由巨噬细胞驱动的炎症反
3、目前，已有多个bcl6小分子抑制剂被报道，如bi-3802。但至今未有bcl6小分子抑制剂进入临床阶段，仍然需要开发新型的bcl6小分子抑制剂。因此，体外抑制活性测试方法以及高通量筛选方法对bcl6小分子抑制剂的发展至关重要。准确、稳定、可靠的活性测试方法，有助于发现结构新颖的先导化合物，指导先导化合物的结构优化以及获得活性更优的候选药物分子，为靶向dlbcl治疗药物的开发奠定基础。
4、荧光偏振是一种能够检测分子间相互作用的方法。通过荧光基团标记配体，进行竞争实验，即可实现待测化合物与受体结合能力的检测。其基本原理是，小分子在溶液中的转动速度比大分子快，因此不结合大分子的荧光化合物产生的偏振值较低；而当荧光化合物与大分子结合之后，转动变慢，从而产生较高的偏振值。因此，荧光偏振是一种可以在微孔板上实现检测，试剂用量少，可以实现高通量筛选的检测方法。
5、如今，运用小分子荧光探针作为辅助工具，多种小分子与生物大分子的作用模式被确定，这些信息对合理药物设计具有十分重要的意义。比如：新的药物靶点的发现，或者对一个已知蛋白的功能做新的阐述，这对于分子水平阐明疾病的发生、发展和治疗尤其重要。以小分子荧光探针作为辅助工具，这些靶点可被发展为高效的高通量筛选模型，并在短时间内随机筛选大量的活性化合物，发现活性更高的小分子化合物作为先导物，用于进一步的药物研发。
6、对于bcl6来说，基于荧光偏振竞争的方法，已经开发出相应的检测方法，或商品化试剂盒。但是尚未见利用荧光偏振方法，使用小分子荧光探针测试化合物与bcl6结合能力的报道。
技术实现思路
1、专利技术目的：本专利技术目的之一在于提供一种bcl6小分子荧光探针。本专利技术提供的化合物具有荧光特性，对bcl6有较好的特异性结合。将该化合物作为荧光偏振探针，通过竞争的方法，可以实现对bcl6配体的筛选及配体亲和力水平的评价。基于本专利技术建立的筛选方法，本专利技术筛选获得了1个可以结合bcl6的小分子化合物，为后续靶向bcl6药物的高通量筛选提供了基础。
2、本专利技术的另一目的在于提供上述化合物的制备方法。
3、本专利技术的另一目的在于提供上述化合物作为荧光偏振探针在bcl6配体筛选中的应用。
4、本专利技术的另一目的在于提供一种bcl6配体筛选的方法。
5、技术方案：本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
6、本专利技术提供了一种式i所示的化合物：
7、
8、本专利技术还提供了上述化合物的制备方法，包括以下步骤：
9、
10、s1：将化合物t1与化合物t2进行酰胺缩合反应，得中间体t3；
11、s2：中间体t3通过脱保护反应，得到中间体t4；
12、s3：中间体t4与荧光素活性酯t5进行缩合反应，即得目标化合物。
13、优选地，步骤s1中，所述化合物t1和化合物t2的摩尔比为1:1～1:2。
14、优选地，步骤s1中，所述酰胺缩合反应的缩合剂为hoat、hobt、hatu、hbtu或bop中的一种或几种。
15、优选地，步骤s1中，所述酰胺缩合反应的碱为n,n-二异丙基乙胺dipea或三乙胺tea中的一种或两种。
16、优选地，所述酰胺缩合反应的有机溶剂为四氢呋喃、乙腈、n,n-二甲基甲酰胺或二甲亚砜中的一种或几种。
17、优选地，步骤s1中，所述酰胺缩合反应的温度为室温，反应时间为12～24h。
18、优选地，步骤s2中，所述脱保护反应的碱为哌啶、三乙胺中的一种或两种。
19、优选地，步骤s2中，所述脱保护反应的有机溶剂为n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷或四氢呋喃中的一种或几种。
20、优选地，步骤s2中，所述脱保护反应的温度为室温，反应时间为12～24h。
21、优选地，步骤s3中，所述化合物t4和荧光素活性酯t5的摩尔比为1:1～1:2。
22、优选地，步骤s3中，所述缩合反应的碱为n,n-二异丙基乙胺或三乙胺中的一种或两种；所述缩合反应的有机溶剂为四氢呋喃、乙腈、n,n-二甲基甲酰胺或二甲亚砜中的一种或几种。
23、优选地，步骤s3中，所述缩合反应的温度为室温，反应时间为12～24h。
24、本专利技术还提供了上述化合物作为荧光偏振探针在bcl6配体筛选中的应用。
25、本专利技术还提供了一种bcl6配体筛选的方法，包括如下步骤：
26、(1)将上述的化合物、包含bcl6配体结合域的蛋白和待测化合物混合得混合物；
27、(2)利用荧光偏振技术测定混合物的偏振值，根据偏振值确认待测化合物是否为bcl6的配体。
28、一般情况下，偏振值降低大于检测窗的25％即可判定其为bcl6的配体。
29、有益效果：
30、本专利技术提供的化合物具有荧光特性，对bcl6有较好的特异性结合。将该化合物作为荧光偏振探针，采用荧光偏振技术，可以实现对bcl6配体的筛选及配体亲和力水平的评价。通过荧光偏振(fluorescence polarization,fp)建立的一种bcl6小分子高通量筛选方案可以用于药物的高通量筛选，具有廉价，稳定，快速，高效等特点。
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1.一种式I所示的化合物：
2.根据权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述化合物T1和化合物T2的摩尔比为1:1～1:2。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述酰胺缩合反应的缩合剂为HOAT、HOBT、HATU、HBTU或BOP中的一种或几种；所述酰胺缩合反应的碱为N，N-二异丙基乙胺DIPEA或三乙胺TEA中的一种或两种；所述酰胺缩合反应的有机溶剂为四氢呋喃、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺或二甲亚砜中的一种或几种。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述脱保护反应的碱为哌啶、三乙胺中的一种或两种；所述脱保护反应的有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷或四氢呋喃中的一种或几种。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述化合物T4和荧光素活性酯T5的摩尔比为1:1～1:2。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述缩合反应的碱为N,N-
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述酰胺缩合反应的温度为室温，反应时间为12～24h；步骤S2中，所述脱保护反应的温度为室温，反应时间为12～24h；步骤S3中，所述缩合反应的温度为室温，反应时间为12～24h。
9.权利要求1所述的化合物作为荧光偏振探针在BCL6配体筛选中的应用。
10.一种BCL6配体筛选的方法，其特征在于，包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种式i所示的化合物：
2.根据权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤s1中，所述化合物t1和化合物t2的摩尔比为1:1～1:2。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤s1中，所述酰胺缩合反应的缩合剂为hoat、hobt、hatu、hbtu或bop中的一种或几种；所述酰胺缩合反应的碱为n，n-二异丙基乙胺dipea或三乙胺tea中的一种或两种；所述酰胺缩合反应的有机溶剂为四氢呋喃、乙腈、n，n-二甲基甲酰胺或二甲亚砜中的一种或几种。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤s2中，所述脱保护反应的碱为哌啶、三乙胺中的一种或两种；所述脱保护反应的有机溶剂为n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷或四氢呋喃中的一种或几种。
【专利技术属性】
技术研发人员：尤启冬，姜正羽，徐如俊，陈学涛，康文静，吴慧丹，闫蕾昕，徐晓莉，郭小可，王磊，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：
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