【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及病菌检测载体及检测应用，尤其涉及致病菌检测用通用水凝胶载体及其作为传感器应用。
技术介绍
1、致病菌检测在公共安全、公共卫生、生命健康领域具有广阔的应用前景。致病菌检测包括定性检测和定量检测，往往定量检测能够给予使用者更为直观的认知，而且往往致病菌检测的时效性同样重要，人们往往希望以更快地速度获知检测结果，很多情况下更加迅速的检测意味着更为实际的使用价值。
2、致病菌检测并非一种新的技术，例如现阶段作为金标准的致病微生物检测仍依赖于时效性较差的微生物培养或pcr扩增仪，通常情况上述检测虽然更为严谨和准确，但受限于时间、设备等因素，往往在很多情形下不能应用。因此，开发一种简单、快速且具有成本效益的定量测定致病菌的方法无疑是具有巨大价值的。
3、具有三维(3d)网络结构的新型高分子材料水凝胶以其稳定性，高性价比和易于保存的优点作为检测平台引起了广泛关注。dna水凝胶其结构使用合成聚合物作为骨架，dna作为交联剂。上述水凝胶依据靶标设置引发水凝胶塌陷的条件，并在此过程中释放用于检测敏感信号的载体。
技术实现思路
1、针对上述问题，本专利技术的目的在于提出一种致病菌检测用通用水凝胶载体，解决致病菌检测过程中时效性不强，无法实现快速现场定量检测的问题。
2、其技术方案是，由透明质酸与dna单链形成偶联物ha-dna，所述偶联物ha-dna与致病菌适配体、双醛壳聚糖二氧化锰纳米酶混合反应，利用羧基与氨基结合以及碱基互补配对，形成偶联物ha-dn
3、在上述或一些实施例中，制备透明质酸混合液，分别配置edc、nhs、透明质酸溶液，混合配置形成edc、nhs、透明质酸溶液混合形成的透明质酸混合液，使得透明质酸混合液羧基活化；
4、于羧基活化后的透明质酸混合液中缓慢滴加单链dna，使得透明质酸混合液中透明质酸羧基与单链dna端部的氨基结合形成偶联物ha-dna；
5、于偶联物ha-dna溶液中正常滴加目标致病菌适配体溶液、双醛壳聚糖二氧化锰纳米酶溶液，混合反应，目标致病菌适配体作为交联剂，通过酸羧基与氨基结合，以及碱基互补配对，形成包埋双醛壳聚糖二氧化锰纳米酶空间三维结构的水凝胶。
6、在上述或一些实施例中，所述中edc溶液的浓度为97.6mg/ml，所述nhs溶液的浓度23mg/ml，所述透明质酸溶液浓度为0.5％-1％；将上述各溶液以体积比1:1:8混合配置形成edc、nhs、透明质酸溶液的透明质酸混合液，并混合均匀，于37℃孵育反应活化羧基。
7、在上述或一些实施例中，于透明质酸混合液中加入滴加浓度为50μm的单链c1dna和c2dna，透明质酸混合液与dna的体积比为4:1，孵育反应得到目标物透明质酸与dna的ha-c1dna、ha-c2dna。
8、在上述或一些实施例中，所述ha-c1dna、ha-c2dna、致病菌适配体、双醛壳聚糖二氧化锰纳米酶混合反应，ha-c1dna：ha-c2dna：致病菌适配体：dac/mno2摩尔体积比为1:1:1:200。
9、本专利技术还提供一种致病菌检测用通用水凝胶载体作为传感器应用，所述水凝胶载体包括致病菌适配体，当致病菌适配体与致病菌接触时，致病菌与致病菌适配体高亲和力结合，导致水凝胶载体的崩解和内部双醛壳聚糖二氧化锰纳米酶的暴露，水凝胶载体的崩解程度与致病菌含量正相关，也即崩解暴露的双醛壳聚糖二氧化锰纳米酶量与致病菌含量正相关；
10、于标准量水凝胶载体溶液中加入的不同浓度致病菌制得标准溶液，孵育反应一段时间后加入足量过氧化氢(h2o2)和显色底物，测定不同浓度致病菌条件下标准溶液在652nm波长下比色信号值，建立检测目标菌种的不同浓度与比色信号值相关的标准曲线；
11、将待测定目标物取样，并加入至标准量水凝胶载体溶液中，孵育反应一段时间后加入足量过氧化氢(h2o2)和显色底物，测定样本在652nm波长下比色信号值，并将所得比色信号值信号代入标准曲线，获得曲线中对应的目标菌种的浓度值。
12、在上述或一些实施例中，所述显色底物为四甲基联苯胺(tmb)。
13、在上述或一些实施例中，所述比色传感体系中四甲基联苯胺(tmb)的浓度为0.5-2.5mm，所述h2o2的浓度为2-10mm。
14、在上述或一些实施例中，所述致病菌为沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、大肠杆菌中的一种或混合。
15、本专利技术食源性致病菌的存在可以与适配体高亲和力结合，并导致水凝胶的崩解和封装dac/mno2的暴露。水凝胶崩解的程度与致病菌的量呈正相关，通过这种方式可以实现对食源性致病菌的定量检测。由于dac/mno2优异的催化性能以及dna水凝胶良好的刺激响应性，所开发的适体传感器表现出良好的分析性能，可以作为检测食源性致病菌的通用平台。此外，本方法具有成本低廉、操作简单、检测灵敏性高的特点。可实现对不同食源性致病菌进行实时现场的定量检测；该方法可用于对致病菌从10-105cfu/ml浓度范围内进行检测，呈现较好的线性关系，在样品检测、食品安全分析等具有广阔的应用前景。
16、说明书附图
17、图1是本专利技术现场定量检测原理示意图。
18、图2为比色传感平台直接检测沙门氏菌的结果图。
19、图3为比色传感平台直接检测大肠杆菌的结果图。
20、图4为比色传感平台直接检测金黄色葡萄球菌的结果图。
21、图5为比色传感平台对沙门氏菌选择性结果图。
22、图6为比色传感平台对大肠杆菌选择性结果图。
23、图7为比色传感平台对金黄色葡萄球菌选择性结果图。
24、图8为本专利技术方法的比色传感平台稳定性柱形图。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.致病菌检测用通用水凝胶载体，由透明质酸与DNA单链形成偶联物HA-DNA，所述偶联物HA-DNA与致病菌适配体、双醛壳聚糖二氧化锰纳米酶混合反应，利用羧基与氨基结合以及碱基互补配对，形成偶联物HA-DNA为骨架，致病菌适配体作为交联剂，形成包埋双醛壳聚糖二氧化锰纳米酶空间三维结构。
2.根据权利要求1所述的致病菌检测用通用水凝胶载体，其特征在于，其特征在于，制备透明质酸混合液，分别配置EDC、NHS、透明质酸溶液，混合配置形成EDC、NHS、透明质酸溶液混合形成的透明质酸混合液，使得透明质酸混合液羧基活化；
3.根据权利要求1所述的致病菌检测用通用水凝胶载体，其特征在于，所述中EDC溶液的浓度为97.6mg/mL，所述NHS溶液的浓度23mg/mL，所述透明质酸溶液浓度为0.5％-1％；将上述各溶液以体积比1:1:8混合配置形成EDC、NHS、透明质酸溶液的透明质酸混合液，并混合均匀，于37℃孵育反应活化羧基。
4.根据权利要求1所述的致病菌检测用通用水凝胶载体，其特征在于，于透明质酸混合液中加入滴加浓度为50μM的单链c1DNA和c2DN
5.根据权利要求1所述的致病菌检测用通用水凝胶载体，其特征在于，所述HA-c1DNA、HA-c2DNA、致病菌适配体、双醛壳聚糖二氧化锰纳米酶混合反应，HA-c1DNA：HA-c2DNA：致病菌适配体：DAC/MnO2摩尔体积比为1:1:1:200。
6.水凝胶载体作为传感器应用，所述水凝胶载体包括致病菌适配体，当致病菌适配体与致病菌接触时，致病菌与致病菌适配体高亲和力结合，导致水凝胶载体的崩解和内部双醛壳聚糖二氧化锰纳米酶的暴露，水凝胶载体的崩解程度与致病菌含量正相关，也即崩解暴露的双醛壳聚糖二氧化锰纳米酶量与致病菌含量正相关；
7.根据权利要求6所述的水凝胶载体作为传感器应用，其特征在于，所述显色底物为四甲基联苯胺(TMB)。
8.根据权利要求6所述的水凝胶载体作为传感器应用，其特征在于，所述比色传感体系中四甲基联苯胺(TMB)的浓度为0.5-2.5mM，所述H2O2的浓度为2-10mM。
9.根据权利要求6-8任一所述的，其特征在于，所述致病菌为沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、大肠杆菌中的一种或混合。
...【技术特征摘要】
1.致病菌检测用通用水凝胶载体，由透明质酸与dna单链形成偶联物ha-dna，所述偶联物ha-dna与致病菌适配体、双醛壳聚糖二氧化锰纳米酶混合反应，利用羧基与氨基结合以及碱基互补配对，形成偶联物ha-dna为骨架，致病菌适配体作为交联剂，形成包埋双醛壳聚糖二氧化锰纳米酶空间三维结构。
2.根据权利要求1所述的致病菌检测用通用水凝胶载体，其特征在于，其特征在于，制备透明质酸混合液，分别配置edc、nhs、透明质酸溶液，混合配置形成edc、nhs、透明质酸溶液混合形成的透明质酸混合液，使得透明质酸混合液羧基活化；
3.根据权利要求1所述的致病菌检测用通用水凝胶载体，其特征在于，所述中edc溶液的浓度为97.6mg/ml，所述nhs溶液的浓度23mg/ml，所述透明质酸溶液浓度为0.5％-1％；将上述各溶液以体积比1:1:8混合配置形成edc、nhs、透明质酸溶液的透明质酸混合液，并混合均匀，于37℃孵育反应活化羧基。
4.根据权利要求1所述的致病菌检测用通用水凝胶载体，其特征在于，于透明质酸混合液中加入滴加浓度为50μm的单链c1dna和c2dna，透明质酸混合液与dna的体积比为4:1，孵育反应得到...
【专利技术属性】
技术研发人员：操小栋，王婷婷，叶永康，何述栋，孙汉巨，
申请(专利权)人：合肥工业大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。