【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于药物检测领域，具体涉及一种基于报告基因检测抗tcrγδ特异性抗体的生物学活性的方法及其应用。
技术介绍
1、相比于传统的抗癌治疗策略，肿瘤免疫治疗被认为拥有更宽阔的前景。其中，双特异性t细胞衔接器(bispecific t-cell engager，bite)是肿瘤免疫治疗一个重要发展方向。bite代表一类具有显著抗肿瘤效应的双特异性抗体，能够靶向性激活自身t细胞杀伤肿瘤细胞。它有两个识别不同靶点的具有特异性识别能力的结构区域，并通过各种特殊的方式连接。其中一个识别t细胞表面蛋白，例如cd3蛋白，而另一个识别特异性肿瘤细胞表面抗原。bite的这种结构和特异性结合蛋白的能力允许它将t细胞物理性地桥接肿瘤细胞，形成t细胞肿瘤细胞复合物，诱导免疫突触形成，刺激t细胞活化，杀伤肿瘤细胞。
2、bite中针对t细胞的特异性识别区，也就是t细胞衔接器(t-cell engager，tce)，目前应用最广泛的就是以cd3作为识别靶点。但以cd3作为t细胞激活靶点，能激活所有的cd3阳性t细胞，因此主要激活占绝大多数比例的αβt细胞，存在功能依赖mhc限制的抗原呈递，组织浸润能力差，炎症因子释放过量风险等缺陷。因此，更加特异性的t细胞靶点成为进一步研究的方向。
3、γδt细胞是一群表达γδt细胞受体(tcrγδ)的t细胞亚群。区别于αβt细胞，其tcr由一条γ链和一条δ链组成。γ链和δ链通常分为v区与c区，c区十分保守，但v区差别很大，常见的人类vγ链有vγ2、vγ3、vγ4、vγ5、vγ8和vγ9等，常见
4、γδt细胞在免疫监视中发挥关键作用，它能够识别多种肿瘤抗原，从而有效的杀死肿瘤细胞。与αβt细胞相比，γδt细胞响应更快速，对肿瘤细胞的识别不依赖于任何单一肿瘤抗原，也不受mhc的限制；γδt细胞具有许多非特异性免疫细胞的特征，能够协调免疫反应；而其较强的组织浸润能力和原位驻留特性使得它们在一系列疾病适应症中具有潜力，包括血液学和实体恶性肿瘤。
5、近年来，基于报告基因测试的检测方法被广泛应用于各种特异性抗体药物的筛选和生物学活性的分析中。报告基因测试法具有原位检测、定量分析、高通量等优点，兼顾了大规模筛选和药物活性导向的需求。tcrγδ作为一个新兴的tce靶点，没有专门为其设计的报告基因测试方案，因此，开发一个基于报告基因测试的检测方法能极大地提升以tcrγδ为靶点的抗体药物的筛选效率。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种基于报告基因检测抗tcrγδ特异性抗体的生物学活性的方法及其应用。本方法基于荧光素酶报告基因法，通过对tcrγδ信号通路的分析，模拟生理状态下的γδt细胞，建立的一种生物学活性检测方法，可用于检测抗tcrγ9链、tcrδ1链和tcrδ2链的单克隆抗体的生物活性。
2、为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种基于报告基因检测抗tcrγδ特异性抗体的生物学活性的方法，所述方法包括：
4、(1)构建过表达人tcrγ9δ1或tcrγ9δ2以及nfat反应元件荧光素酶报告基因的jurkat效应细胞；
5、(2)培养所述jurkat效应细胞，通过荧光素酶报告基因法检测待测样品中抗tcrγδ特异性抗体的生物学活性。
6、本专利技术通过将jurkat细胞表面的tcrαβ置换为tcrγδ，并利用原有的完整tcr下游信号通路和nfat-re-luc2p报告基因，在tcrγδ激活的情况下，刺激大量荧光素酶蛋白表达，来指示tcrγδ的激活程度。此方案实现了天然的tcrγδ-cd3复合物组装，无需过表达cd3复合物，也无需过表达任何tcr下游信号通路蛋白，尽可能的模拟生理状态下的γδt细胞，为靶向γδt细胞的肿瘤免疫治疗新药的筛选和评价提供了有效手段。
7、优选地，步骤(1)中，所述过表达人tcrγ9δ1或tcrγ9δ2以及nfat反应元件荧光素酶报告基因的jurkat效应细胞采用包括如下步骤的方法构建得到：
8、将nfat-re-luc2p荧光素酶报告基因导入jurkat细胞中，进一步采用crispr/cas9技术敲除jurkat细胞中编码tcrβ链的基因，再将编码tcrγ9δ1或tcrγ9δ2的核苷酸序列整合到jurkat细胞染色体中，得到jurkat效应细胞。
9、优选地，将nfat-re-luc2p荧光素酶报告基因整合在质粒上，通过质粒转染的方式导入jurkat细胞中。
10、优选地，靶向所述tcrβ链的grna的核苷酸如seq id no:1所示。
11、优选地，将编码tcrγ9δ1或tcrγ9δ2的核苷酸序列克隆到慢病毒表达载体上，进行慢病毒包装，采用包装后的慢病毒颗粒感染基因敲除后的jurkat细胞。
12、优选地，所述慢病毒包装采用的包装质粒包括pspax.2质粒和pmd2.g质粒。
13、优选地，所述tcrγ9δ1由多肽p2a将tcrγ9链与tcrδ1链隔开，所述tcrγ9δ2由多肽p2a将tcrγ9链与tcrδ2链隔开。
14、优选地，所述tcrγ9δ1的氨基酸序列如seq id no:2所示。
15、优选地，所述tcrγ9δ2的氨基酸序列如seq id no:3所示。
16、本专利技术中，所述过表达人tcrγ9δ1或tcrγ9δ2以及nfat反应元件荧光素酶报告基因的jurkat效应细胞可以用于评估抗tcrγδ抗体(包括抗vγ9抗体、抗vδ1抗体)的生物学活性，抗tcrγδ抗体通过其对tcrγδ的特异性识别与亲和力，结合于jurkat效应细胞表面的tcrγδ-cd3复合物，激活tcr下游信号，从而激活效应细胞，最终体现为荧光素酶表达上调与荧光信号上升。其中，抗vγ9抗体、抗vδ1抗体分别特异性识别tcrγ9δ1-cd3复合物的vγ9和vδ1，都显示出对jurkat效应细胞的激活作用，而且这种作用具有剂量依赖性，而同型对照抗体则没有任何作用。
17、优选地，步骤(2)中，所述荧光素酶报告基因法检测的步骤包括：
18、(a)用包被抗体包被酶标板，所述包被抗体为抗人igg-fcγ片段抗体；
19、(b)将待测样品加入酶标板中并孵育；
20、(c)将jurkat效应细胞加入酶标板中并孵育；
21、(d)将发光底物加入酶标板中并孵育，孵育结束，进行荧光强度的检测。
22、本专利技术中，所述包被抗体为非人源抗igg-fcγ片段抗体，例如山羊抗人igg-fcγ片段抗体、小鼠抗人igg-fcγ片段抗体等都可以作为本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于报告基因检测抗TCRγδ特异性抗体的生物学活性的方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的基于报告基因检测抗TCRγδ特异性抗体的生物学活性的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述过表达人TCRγ9δ1或TCRγ9δ2以及NFAT反应元件荧光素酶报告基因的Jurkat效应细胞采用包括如下步骤的方法构建得到：
3.根据权利要求2所述的基于报告基因检测抗TCRγδ特异性抗体的生物学活性的方法，其特征在于，将NFAT-RE-luc2P荧光素酶报告基因整合在质粒上，通过质粒转染的方式导入Jurkat细胞中；
4.根据权利要求2或3所述的基于报告基因检测抗TCRγδ特异性抗体的生物学活性的方法，其特征在于，将编码TCRγ9δ1或TCRγ9δ2的核苷酸序列克隆到慢病毒表达载体上，进行慢病毒包装，采用包装后的慢病毒颗粒感染基因敲除后的Jurkat细胞；
5.根据权利要求1-4中任一项所述的基于报告基因检测抗TCRγδ特异性抗体的生物学活性的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述荧光素酶报告基因法检测的步骤包括：
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