【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术，涉及一种逆转录病毒载体，具体为一种高转导活性自失活逆转录病毒载体，减少逆转录病毒载体在临床治疗应用中面临的安全性问题。
技术介绍
1、逆转录病毒载体(rv)具有整合特性，支持外源基因在宿主细胞中的长期表达，广泛应用于细胞治疗。目前rv通用的是ltr驱动的野生型骨架，当野生型rv随机整合到哺乳动物基因组中时，ltr中携带的启动子及增强子潜在激活整合位点侧翼宿主基因的表达。当整合发生在癌基因附近时，有激活原癌基因，引起肿瘤发生的风险。同时，ltr驱动转录出病毒rna，增加复制型逆转录病毒风险。为了减少逆转录病毒载体在临床治疗应用中面临的安全性问题，目前已发展出自失活(self-inactivating，sin) rv载体，这类载体缺失5’-ltr u3区域，同时缺失3’-ltr u3区的部分序列，降低了整合致癌和复制型逆转录病毒形成的风险。由于自失活改造删除启动子区域，通常会在病毒载体内部加入新的启动子，驱动目标基因的转录；然而自失活载体制备的逆转录病毒载体产量较低，限制了自失活rv载体的临床应用。
技术实现思路
1、本专利技术公开了一种高转导活性自失活逆转录病毒载体，减少逆转录病毒载体在临床治疗应用中面临的安全性问题；在自失活逆转录病毒载体的基础上，本专利技术设计新的自失活逆转录病毒载体内置短启动子，同时在短启动子后面加上内含子（比如小鼠微小病毒内含子mvm intron），出乎意料的提高逆转录病毒载体的产量和转导效率。
2、本专利技术采用如下技术
3、一种高转导活性自失活逆转录病毒载体，包括自失活逆转录病毒载体；其中，所述自失活逆转录病毒载体的启动子为efs启动子、pgk启动子或者ubc启动子。进一步的，efs启动子后面接有内含子；所述内含子包括小鼠微小病毒内含子、腺病毒sd/免疫球蛋白sa（adenovirus sd/immunoglobulin sa）、猿猴空泡病毒40 sd/sa（sv40 sd/sa）中的一种或几种。
4、一种表达car的高转导活性自失活逆转录病毒载体，包括上述高转导活性自失活逆转录病毒载体以及嵌合抗原受体（car）。
5、一种病毒颗粒，包括上述表达car的高转导活性自失活逆转录病毒载体。
6、一种宿主细胞，包括上述表达car的高转导活性自失活逆转录病毒载体。
7、一种免疫效应细胞，包括由上述表达car的高转导活性自失活逆转录病毒载体表达的car。
8、本专利技术公开了上述高转导活性自失活逆转录病毒载体、表达car的高转导活性自失活逆转录病毒载体、病毒颗粒、宿主细胞或者免疫效应细胞在制备免疫治疗药物中的应用。
9、本专利技术中，高转导活性自失活逆转录病毒载体还包括外置启动子、5’-ltr（△u3）、包装信号、3’-ltr（△u3），这些都为现有技术；其中5’-ltr（△u3）、3’-ltr（△u3）是指在5’ltr和3’ltr缺失了对病毒复制和基因转录起重要作用的u3序列，使rv成为自灭活载体，丧失了复制能力。优选的，本专利技术的高转导活性自失活逆转录病毒载体由外置启动子、5’-ltr（△u3）、包装信号、短启动子（efs启动子、pgk启动子或者ubc启动子）、内含子（小鼠微小病毒内含子、腺病毒sd/免疫球蛋白sa、猿猴空泡病毒40 sd/sa）、car、3’-ltr（△u3）串联而成。
10、作为应用示例，在小鼠微小病毒内含子、3’-ltr（△u3）之间插入编码car的序列，得到表达car的高转导活性自失活逆转录病毒载体。
11、上述高转导活性自失活逆转录病毒载体的制备方法，包括以下步骤，以自失活逆转录病毒载体为基础，以短启动子（efs启动子、pgk启动子或者ubc启动子）替换原有内置启动子，得到高转导活性自失活逆转录病毒载体；或者以自失活逆转录病毒载体为基础，以短启动子（efs启动子、pgk启动子或者ubc启动子）替换原有内置启动子并后接内含子（小鼠微小病毒内含子、腺病毒sd/免疫球蛋白sa、猿猴空泡病毒40 sd/sa），得到高转导活性自失活逆转录病毒载体。
12、本专利技术中，外置启动子为cmv启动子或者其他常规外置启动子。
13、为了减少逆转录病毒载体在临床治疗应用中面临的安全性问题，现有技术缺失5’-ltr u3区域，同时缺失3’-ltr u3区的部分序列，降低了整合致癌和复制型逆转录病毒形成的风险，但是现有自失活载体制备的逆转录病毒载体产量较低，限制了自失活rv载体的临床应用。与现有的自失活逆转录病毒载体相比，作为优选，本专利技术采用efs启动子结合mvm内含子制备的自失活rv产量提高217%，转导效率提高220%，外源基因表达强度也有所提高。
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1.一种高转导活性自失活逆转录病毒载体，包括自失活逆转录病毒载体，其特征在于，所述自失活逆转录病毒载体的启动子为EFS启动子、PGK启动子或者UBC启动子。
2.根据权利要求1所述高转导活性自失活逆转录病毒载体，其特征在于，EFS启动子接有内含子；所述内含子包括小鼠微小病毒内含子、腺病毒SD/免疫球蛋白SA、猿猴空泡病毒40 SD/SA中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述高转导活性自失活逆转录病毒载体，其特征在于，还包括外置启动子、5’-LTR（△U3）、包装信号、3’-LTR（△U3）。
4.权利要求1或者2所述高转导活性自失活逆转录病毒载体的制备方法，其特征在于，以自失活逆转录病毒载体为基础，以EFS启动子、PGK启动子或者UBC启动子替换原有内置启动子，得到高转导活性自失活逆转录病毒载体；或者以自失活逆转录病毒载体为基础，以EFS启动子、PGK启动子或者UBC启动子替换原有内置启动子并后接内含子，得到高转导活性自失活逆转录病毒载体。
5.一种表达嵌合抗原受体的高转导活性自失活逆转录病毒载体，其特征在于，包括权利要求1所述高
6.一种病毒颗粒，其特征在于，包括权利要求1所述表达嵌合抗原受体的高转导活性自失活逆转录病毒载体。
7.一种宿主细胞，其特征在于，包括权利要求1所述表达嵌合抗原受体的高转导活性自失活逆转录病毒载体。
8.一种免疫效应细胞，其特征在于，包括权利要求5所述表达嵌合抗原受体的高转导活性自失活逆转录病毒载体表达的嵌合抗原受体。
9.权利要求1所述高转导活性自失活逆转录病毒载体作为或者在制备基因载体中的应用。
10.权利要求1或2所述高转导活性自失活逆转录病毒载体、权利要求5所述表达嵌合抗原受体的高转导活性自失活逆转录病毒载体、权利要求6所述病毒颗粒、权利要求7所述宿主细胞或者权利要求8所述免疫效应细胞在制备免疫治疗药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种高转导活性自失活逆转录病毒载体，包括自失活逆转录病毒载体，其特征在于，所述自失活逆转录病毒载体的启动子为efs启动子、pgk启动子或者ubc启动子。
2.根据权利要求1所述高转导活性自失活逆转录病毒载体，其特征在于，efs启动子接有内含子；所述内含子包括小鼠微小病毒内含子、腺病毒sd/免疫球蛋白sa、猿猴空泡病毒40 sd/sa中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述高转导活性自失活逆转录病毒载体，其特征在于，还包括外置启动子、5’-ltr（△u3）、包装信号、3’-ltr（△u3）。
4.权利要求1或者2所述高转导活性自失活逆转录病毒载体的制备方法，其特征在于，以自失活逆转录病毒载体为基础，以efs启动子、pgk启动子或者ubc启动子替换原有内置启动子，得到高转导活性自失活逆转录病毒载体；或者以自失活逆转录病毒载体为基础，以efs启动子、pgk启动子或者ubc启动子替换原有内置启动子并后接内含子，得到高转导活...
【专利技术属性】
技术研发人员：马力，莫家露，孙明，
申请(专利权)人：南京恩瑞恺诺生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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