【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学检测，具体涉及一种免研磨革兰氏阴性菌rna快速提取试剂、制备方法制备方法及其应用。
技术介绍
1、革兰氏阴性菌泛指革兰氏染色反应呈红色的细菌，在生物界大量存在，种类繁多；rna是除dna外的存储遗传信息的主要载体，快速提取高纯度和完整性的rna是微生物分子生物学研究的必要前提，在研究其致病性及发现治疗手段方面具有重要意义。
2、提取完整的细菌总rna是研究细菌毒力基因表达与其致病性和环境适应性以及细菌耐药基因和与生物被膜形成相关的基因的基础；然而细菌rna含量少和半衰期很短，没有5′帽子结构和3′poly(a)尾巴的特点，使其在提取过程中容易降解；且费时费力。
3、目前，常见的rna提取方法有trizol法、sds-phenol法、ctab法、(改良)热硼酸法，这些方法共同的特点是需要液氮研磨破碎细胞壁，常规技术费时费力，使用液氮研磨后进行提取细菌rna，然后进行反转录和qpcr，常规方法提取细菌样本rna步骤繁琐，提取一个样本耗时大于40分钟，费时费力；并且市售试剂盒提取每个样本花费的金额大于20元，成本很高；市面上几乎没有能够不使用研磨就能有效的裂解细菌细胞，快速提取细菌rna的试剂。
技术实现思路
1、针对现有技术中存在的不足，本专利技术提供一种免研磨革兰氏阴性菌rna快速提取试剂、制备方法及其应用。本专利技术制备方法条件温和，制备得到的革兰氏阴性菌rna快速提取试剂可以快速破坏革兰氏阴性菌细胞壁，从而释放出rna，用于rt-q
2、一种免研磨革兰氏阴性菌rna快速提取试剂，其中：包括以下组分：
3、乙二胺四乙酸1.75-7.00g/l，十二烷基硫酸钠0.25-8.00g/l，巯基乙醇0.5-3％，甲酰胺55％-95％。
4、优选的是，所述的免研磨革兰氏阴性菌rna快速提取试剂，其中：所述乙二胺四乙酸的浓度为3.5-7.00g/l。
5、一种免研磨革兰氏阴性菌rna快速提取试剂的制备方法，其中：包括以下步骤：
6、称取1.75-7.00g的edta，0.25-8.00g sds置于600ml烧杯中，加入5.00-30ml的巯基乙醇，750ml以上的甲酰胺，溶解后加无菌水定容至1000ml，得到免研磨革兰氏阴性菌rna快速提取试剂。
7、一种免研磨革兰氏阴性菌rna快速提取试剂在提取革兰氏阴性菌rna领域的应用。优选的，应用方法如下：
8、s1.将内含大肠杆菌细胞的细菌培养液离心，弃掉上清液，收集大肠杆菌的细胞沉淀备用；
9、s2.将1.75-7.00g/l乙二胺四乙酸、0.25-8.00g/l十二烷基硫酸钠、0.5-3％巯基乙醇和55％-95％甲酰胺混合得到革兰氏阴性菌rna快速提取试剂；
10、s3.将革兰氏阴性菌rna快速提取试剂中加入约含108个大肠杆菌的细胞沉淀于离心管中，涡旋使细胞重新悬浮，之后将细胞孵育，然后在室温下离心，收集上清液即得到革兰氏阴性菌rna。
11、优选的是，所述的应用，其中：步骤s1的离心力为16000g，离心时间为30-60s。
12、优选的是，所述的应用，其中：步骤s3的孵育温度为90-95℃，孵育时间为7～10min。
13、优选的是，所述的应用，其中：步骤s3的离心力为16000g，离心时间为5-8min。
14、本专利技术的优点：
15、(1)本专利技术的免研磨革兰氏阴性菌rna快速提取试剂，裂解缓冲体系可以快速破坏革兰氏阴性菌细胞壁，从而释放出rna，用于rt-qpcr反应，消除了费时费力的rna纯化过程，只需15min便可以得到所需要的rna模板。
16、(2)本专利技术的免研磨革兰氏阴性菌rna快速提取试剂的应用方法，操作简单，只需通过震荡、孵育和离心即可以得到用于核酸扩增的模板，提取rna纯度高，无抑制剂，跟各种后续实验兼容，包括pcr、rt-qpcr，产率高，同样的样本量提取的rna更多，环保健康，不含苯酚和氯仿等有毒溶剂，安全无毒；成本低廉，不足市售价格的1/10，可用于大规模高通量体外筛选。
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1.一种免研磨革兰氏阴性菌RNA快速提取试剂，其特征在于：包括以下组分：
2.根据权利要求1所述的免研磨革兰氏阴性菌RNA快速提取试剂，其特征在于：所述乙二胺四乙酸的浓度为3.5-7.00g/L。
3.根据权利要求1～2任一项所述的免研磨革兰氏阴性菌RNA快速提取试剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
4.一种如权利要求1-2任一项所述的免研磨革兰氏阴性菌RNA快速提取试剂在提取革兰氏阴性菌RNA领域的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：应用方法如下：
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：步骤S1的离心力为16000g，离心时间为30-60s。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：步骤S3的细胞孵育温度为90-95℃，孵育时间为7～10min。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：步骤S3的离心力为16000g，离心时间为5-8min。
【技术特征摘要】
1.一种免研磨革兰氏阴性菌rna快速提取试剂，其特征在于：包括以下组分：
2.根据权利要求1所述的免研磨革兰氏阴性菌rna快速提取试剂，其特征在于：所述乙二胺四乙酸的浓度为3.5-7.00g/l。
3.根据权利要求1～2任一项所述的免研磨革兰氏阴性菌rna快速提取试剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
4.一种如权利要求1-2任一项所述的免研磨革兰氏阴性菌rna快速提取试剂在提取革兰氏阴性...
【专利技术属性】
技术研发人员：何骁腾，李剑锋，蒋震，洪利华，
申请(专利权)人：杭州大立过滤设备有限公司，
类型：发明
国别省市：
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