【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术实施方案涉及特异性结合分化簇71(cd71)的纤连蛋白iii型结构域(fn3)以及制备和使用所述分子的方法。
技术介绍
1、cd71(也称为转铁蛋白受体1)是跨膜的，其对于细胞中的铁转运至关重要。其在许多肿瘤类型上和血脑屏障处高度表达，并且由此已成为药物递送的重要靶标。在结合至载铁转铁蛋白后，cd71被快速内吞并有效地再循环回到细胞表面。使用cd71抗体药物缀合物的研究表明，靶向cd71可改进药物递送的特异性和选择性并拓宽治疗指数。另外，使用抗cd71单克隆抗体的研究指示，结合亲和力可在实现组织特异性递送(包括平滑肌或骨骼肌递送)和血脑屏障胞吞转运中发挥重要作用。对cd71具有高亲和力的抗体可快速内化并改变正常受体输送，使得受体靶向溶酶体以供降解而非发生再循环。与之相比，对cd71具有低亲和力的抗体容许受体再循环并具有较高脑暴露。
2、在期望对目标分子具有高亲和力和特异性时，尽管抗体或抗体片段是最广泛使用的治疗蛋白种类，但非抗体蛋白也可经工程化以结合此类靶标。这些“替代架构”蛋白优于传统抗体，这是因为其尺寸小，缺少二硫化键，稳定性高，能够表达于原核宿主中，易于纯化，并且它们易于缀合至药物/毒素、可有效渗透至组织中并易于格式化成多特异性结合剂。
3、一种此类替代架构是免疫球蛋白(ig)折叠。这种折叠存在于抗体可变区以及数千种非抗体蛋白中。已证实，一种此类ig蛋白是来自人类纤连蛋白的第十纤连蛋白iii型(fn3)重复，其可耐受表面暴露环中的众多突变并且同时保留整体ig折叠结构。因此，需要可特异性结合
技术实现思路
1、在一些实施方案中，提供了特异性结合cd71蛋白的fn3结构域(例如多肽)。在一些实施方案中，所述fn3结构域是经分离的。在一些实施方案中，所述fn3结构域是重组的。在一些实施方案中，所述fn3结构域是非天然存在的。
2、在一些实施方案中，提供了包含seq id no:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306，292-299或304-306，或304-306的氨基酸序列的fn3结构域。在一些实施方案中，所述fn3结构域结合至cd71。在一些实施方案中，所述fn3结构域在人类cd71上不与转铁蛋白竞争结合至cd71的位点处结合至cd71。在一些实施方案中，所述fn3结构域特异性结合至cd71。在一些实施方案中，提供了包含多于一个由接头(例如柔性接头)连结的fn3结构域的多肽。在一些实施方案中，所述多肽包含2、3或4个fn3结构域，所述fn3结构域由结构域之间的一个或多个接头彼此连结。
3、在一些实施方案中，提供了编码本文所阐述的fn3结构域的经分离多核苷酸。
4、在一些实施方案中，提供了包含本文所阐述的多核苷酸的载体。
5、在一些实施方案中，提供了包含本文所阐述的载体的宿主细胞。
6、在一些实施方案中，提供了产生fn3结构域的方法。在一些实施方案中，所述方法包括培养包含编码或表达fn3结构域的载体的宿主细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括纯化fn3结构域。在一些实施方案中，所述fn3结构域特异性结合cd71。
7、在一些实施方案中，提供了药物组合物，其包含结合至cd71的fn3结构域和药学上可接受的载剂。
8、在一些实施方案中，提供了结合fn3结构域(其结合至cd71)的抗独特型抗体。
9、在一些实施方案中，提供了包含一个或多个fn3结构域的试剂盒。
10、在一些实施方案中，提供了检测肿瘤组织中的表达cd71的癌细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括从受试者获得所述肿瘤组织样品，以及通过使所述肿瘤组织样品与fn3结构域接触并检测cd71蛋白与所述fn3结构域之间的结合来检测cd71蛋白是否在所述肿瘤组织中表达，所述fn3结构域结合包含seq id no:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306，或304-306中的一者的氨基酸序列的cd71蛋白。
11、在一些实施方案中，提供了分离表达cd71的细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括从受试者获得样品；使所述样品与fn3结构域接触，所述fn3结构域结合包含seqid no:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306，或304-306中的一者的氨基酸序列的cd71蛋白；以及分离结合至所述fn3结构域的细胞。
12、在一些实施方案中，提供了检测肿瘤组织中的表达cd71的癌细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使fn3结构域缀合至可检测标记以形成缀合物，所述fn3结构域结合包含seq id no:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306，或304-306中的一者的氨基酸序列的cd71蛋白；将所述缀合物施用于受试者；以及使所述缀合物所结合的表达cd71的癌细胞可视化。
13、在一些实施方案中，提供了治疗有需要的受试者的癌症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用结合至cd71的多肽或药物组合物。在一些实施方案中，所述多肽是结合至cd71的fn3结构域。在一些实施方案中，所述多肽包含例如seq id no:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306的序列，或如本文所提供连接至或缀合至治疗剂的多肽。
14、在一些实施方案中，结合至cd71的多肽是针对中枢神经系统。在一些实施方案中，提供了治疗有需要的受试者的神经疾患和/或脑肿瘤的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用结合至cd71的多肽或药物组合物。在一些实施方案中，所述多肽是结合至cd71的fn3结构域。在一些实施方案中，所述多肽包含例如seq id no:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306的序列，或如本文所提供连接至或缀合至治疗剂的多肽。在一些实施方案中，所述脑肿瘤选自由以下组成的组：非恶性脑肿瘤、良性脑肿瘤和恶性脑肿瘤。在一些实施方案中，所述神经疾患选自由以下组成的组：阿尔茨海默病(alzheimer'sdisease)、肌萎缩性侧索硬化、帕金森病(parkinson's disease)、拉弗拉病(laforadisease)、庞贝病(pompe disease)、成人葡聚糖体病、中风、脊髓损伤、共济失调、贝尔氏麻痹(bell's palsy)、脑动脉瘤、癫痫、抽搐、格林-巴利综合征(guillain-barre syndrome)、多发性硬化、肌营养不良、神经皮肤综合征、偏头痛、脑炎、败血病和重症肌无力。
15、在一些实施方案中，结合至cd71的多肽是针对肌细胞。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用结合至cd71的多肽或药物组合物。在一些实施方案中，所述多肽是本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:273的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％或90％同一的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的多肽，其中所述多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306。
3.如权利要求2所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306中的两者。
4.一种多肽，所述多肽在人类CD71上的不与转铁蛋白竞争结合至CD71的位点处结合至CD71。
5.如权利要求4所述的多肽，其中所述多肽包含与具有SEQ ID NO:273的序列的多肽至少70％、75％、80％、85％或90％同一的氨基酸序列。
6.如权利要求4所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306的序列。
7.如权利要求1-6中任一项所述的多肽，其中所述多肽缀合至可检测标记、寡核苷
8.如权利要求7所述的多肽，其中所述可检测标记是放射性同位素、磁珠、金属珠、胶态颗粒、荧光染料、电子致密试剂、酶、生物素、地高辛或半抗原。
9.如权利要求7或8所述的多肽，其中所述可检测标记是奥里斯他汀、单甲基奥里斯他汀苯丙氨酸、多拉斯他汀、化学治疗剂、药物、生长抑制剂、毒素或放射性同位素。
10.如权利要求7所述的多肽，其中所述治疗剂是化学治疗剂、药物、抗体、生长抑制剂、毒素、放射性同位素、抗微管蛋白剂、多核苷酸、siRNA分子或其有义或反义链、反义分子或其链、RNA分子、DNA分子、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷基化剂、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢物、化学疗法敏化剂、拓扑异构酶抑制剂或长春花生物碱。
11.如权利要求7所述的多肽，其中所述治疗剂可通过调节基因表达、RNA表达或水平、微管蛋白结合、DNA结合、拓扑异构酶抑制、DNA交联、螯合、剪接体抑制、NAMPT抑制或HDAC抑制来诱发一种或多种细胞毒性效应。
12.如权利要求1-11中任一项所述的多肽，所述多肽进一步在所述多肽的N末端处包含甲硫氨酸。
13.如权利要求1-12中任一项所述的多肽，其中所述多肽偶联至半衰期延长部分。
14.如权利要求13所述的多肽，其中所述半衰期延长部分是白蛋白结合分子、聚乙二醇(PEG)、白蛋白、白蛋白变体、免疫球蛋白的Fc区的至少一部分。
15.如权利要求14所述的多肽，其中所述白蛋白结合分子是结合白蛋白或白蛋白变体的第二多肽。
16.一种经分离多核苷酸，所述经分离多核苷酸编码权利要求1-15中任一项所述的多肽。
17.一种载体，所述载体包含权利要求16所述的多核苷酸。
18.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求17所述的载体。
19.一种产生结合CD71的多肽的方法，所述方法包括在表达所述多肽的条件下培养权利要求18所述的经分离宿主细胞，以及纯化所述多肽。
20.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-15中任一项所述的多肽和药学上可接受的载剂。
21.一种抗独特型抗体，所述抗独特型抗体结合权利要求1-15中任一项所述的多肽。
22.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1-15中任一项所述的多肽。
23.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所提供的多肽，例如SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306与治疗剂。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述癌症是脑癌。
25.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用与抗病毒剂、免疫系统调节剂或核酸分子缀合的本文所阐述的多肽，例如SEQ ID NO:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述癌症疾病是胶质母细胞瘤。
27.一种检测肿瘤组织中的表达CD71的癌细胞的方法，所述方法包括
28.一种分离表达CD71的细胞的方法，所述方法包括
29.一种检测肿瘤组织中的表达CD71的癌细胞的方法，所述方法包括
30.一种治疗神经疾患和/或脑肿瘤的方法，所述方法包括向受试者施用权利要求20所述的药物组合物。
31.如权利要求3...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种多肽，所述多肽包含与seq id no:273的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％或90％同一的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的多肽，其中所述多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：seq id no:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306。
3.如权利要求2所述的多肽，其中所述多肽包含seq id no:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306中的两者。
4.一种多肽，所述多肽在人类cd71上的不与转铁蛋白竞争结合至cd71的位点处结合至cd71。
5.如权利要求4所述的多肽，其中所述多肽包含与具有seq id no:273的序列的多肽至少70％、75％、80％、85％或90％同一的氨基酸序列。
6.如权利要求4所述的多肽，其中所述多肽包含seq id no:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306的序列。
7.如权利要求1-6中任一项所述的多肽，其中所述多肽缀合至可检测标记、寡核苷酸、治疗剂或其任何组合。
8.如权利要求7所述的多肽，其中所述可检测标记是放射性同位素、磁珠、金属珠、胶态颗粒、荧光染料、电子致密试剂、酶、生物素、地高辛或半抗原。
9.如权利要求7或8所述的多肽，其中所述可检测标记是奥里斯他汀、单甲基奥里斯他汀苯丙氨酸、多拉斯他汀、化学治疗剂、药物、生长抑制剂、毒素或放射性同位素。
10.如权利要求7所述的多肽，其中所述治疗剂是化学治疗剂、药物、抗体、生长抑制剂、毒素、放射性同位素、抗微管蛋白剂、多核苷酸、sirna分子或其有义或反义链、反义分子或其链、rna分子、dna分子、dna小沟结合剂、dna复制抑制剂、烷基化剂、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢物、化学疗法敏化剂、拓扑异构酶抑制剂或长春花生物碱。
11.如权利要求7所述的多肽，其中所述治疗剂可通过调节基因表达、rna表达或水平、微管蛋白结合、dna结合、拓扑异构酶抑制、dna交联、螯合、剪接体抑制、nampt抑制或hdac抑制来诱发一种或多种细胞毒性效应。
12.如权利要求1-11中任一项所述的多肽，所述多肽进一步在所述多肽的n末端处包含甲硫氨酸。
13.如权利要求1-12中任一项所述的多肽，其中所述多肽偶联至半衰期延长部分。
14.如权利要求13所述的多肽，其中所述半衰期延长部分是白蛋白结合分子、聚乙二醇(peg)、白蛋白、白蛋白变体、免疫球蛋白的fc区的至少一部分。
15.如权利要求14所述的多肽，其中所述白蛋白结合分子是结合白蛋白或白蛋白变体的第二多肽。
16.一种经分离多核苷酸，所述经分离多核苷酸编码权利要求1-15中任一项所述的多肽。
17.一种载体，所述载体包含权利要求16所述的多核苷酸。
18.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求17所述的载体。
19.一种产生结合cd71的多肽的方法，所述方法包括在表达所述多肽的条件下培养权利要求18所述的经分离宿主细胞，以及纯化所述多肽。
20.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-15中任一项所述的多肽和药学上可接受的载剂。
21.一种抗独特型抗体，所述抗独特型抗体结合权利要求1-15中任一项所述的多肽。
22.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1-15中任一项所述的多肽。
23.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所提供的多肽，例如seq id no:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306与治疗剂。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述癌症是脑癌。
25.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用与抗病毒剂、免疫系统调节剂或核酸分子缀合的本文所阐述的多肽，例如seq id no:1-7、10、12-219、221-272、292-299或304-306。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述癌症疾病是胶质...
【专利技术属性】
技术研发人员：R·C·阿迪斯，Z·德鲁齐娜，R·V·科拉科夫斯基，S·G·纳德勒，K·T·奥尼尔，忻尧，
申请(专利权)人：ARO生物疗法公司，
类型：发明
国别省市：
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