【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，特别是基于crispr-cas13d系统的靶向组织蛋白酶的sgrna及其应用。
技术介绍
1、猫冠状病毒(fcovs)是家猫的一种重要胃肠道病原体，已知在家猫和多猫家庭中普遍存在。通过血清学和序列分析可以区分两种型fcov，分别称为猫科肠道冠状病毒(fecv)和猫科感染性腹膜炎病毒(fipv)，它们的毒力在本质上不同，这两种生物型存在于血清型i和ii中。猫冠状病毒(fcov)作为一种囊膜病毒，通过网格蛋白与小窝蛋白非依赖型途径入胞，高度依赖于ph值，以及宿主细胞的组织蛋白酶b(ctsb)和组织蛋白酶l(ctsl)活性；ctsb和ctsl被认为是一种重要的内体半胱氨酸蛋白酶，可介导尖峰s蛋白启动和病毒通过病毒-宿主细胞内体膜融合进入；研究表明宿主细胞组织蛋白酶可能在不同生物型的猫冠状病毒中显示的不同作用，ctsb是介导fcov进入的重要的蛋白酶(ii型fecv和fipv)，ctsl可能具有次要的作用(ii型fecv)(regan ad，shraybman r，cohen rd，whittakergr.differential role for low ph and cathepsin-mediated cleavage of the viralspike protein during entry of serotype ii feline coronaviruses.veterinarymicrobiology.2008；132：235-48.)。
2、cas13系统能够特异性靶向编辑rna，cri
3、比如，公开号为cn114836418a的专利技术申请公开了一种用于敲降猪流行性腹泻病毒的crispr-cas13d系统，构建筛选靶向pedv表达阅读框的sgrna高效作用靶点的荧光报告系统，利用crispr-cas13d高效切割mrna的特性，进行高效率sgrnas的快速筛选，然后利用筛选出的高效靶向结合的sgrnas进行crispr-cas13d系统对靶病毒的高效降解。
4、然而，到目前为止，还没有相关研究基于cas13d系统敲降ctsb、ctsl从而抑制猫冠状病毒感染的策略。
技术实现思路
1、基于现有技术中的不足，本专利技术提供了基于crispr-cas13d系统的靶向组织蛋白酶的sgrna及其应用。申请人开发了一种针对组织蛋白酶b、组织蛋白酶l设计sgrna，在和3t3细胞(小鼠胚胎成纤维细胞)上进行验证，证明sgrna能够有效发挥作用，并进一步验证了ctsb、ctsl的敲降能抑制fecv的感染，在本研究中，我们将sgrna及cas蛋白共同用lnps(纳米脂质体)包裹，递送到ad5-fapn小鼠体内，验证其进行体内敲降的效率，以及抑制fecv感染的效率，发现能够敲低小鼠肠道ctsb、ctsl的表达，也能够有效抑制fcov的感染。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、本专利技术提供了基于crispr-cas13d系统的靶向组织蛋白酶的sgrna，所述组织蛋白酶为组织蛋白酶b和组织蛋白酶l，其中，靶向组织蛋白酶b的sgrna序列如seq id no.1所示，靶向组织蛋白酶l的sgrna序列如seq id no.2所示。
4、另一方面，本专利技术还提供了一种载体，包含编码所述sgrna的核苷酸序列。所述载体中还包含编码cas13d核酸酶的核苷酸序列。
5、另一方面，本专利技术还提供了用于敲降组织蛋白酶的crispr-cas13d系统，包含所述的载体。
6、另一方面，本专利技术还提供了一种组合物，包括以下i～iv中至少一种：
7、i.cas13d核酸酶和所述的sgrna；
8、ii.编码cas13d核酸酶的核酸分子和编码所述sgrna的核酸分子；
9、iii.cas13d核酸酶，和编码所述sgrna的核酸分子；
10、iv.编码cas13d核酸酶的核酸分子，和所述的sgrna。
11、另一方面，本专利技术还提供了一种试剂盒，包括所述的sgrna、所述的载体或所述的组合物。
12、另一方面，本专利技术还提供了一种药物，所述药物含有所述的sgrna、所述的载体或所述的组合物，以及药学上可接受的辅料。
13、相比传统疫苗，mrna的安全性更有优势，不会插入基因突变，可以被正常细胞降解，通过调节序列修饰和递送载体可以改变其半衰期等。而lnps技术能够包裹mrna并精准的递送到生物体内，具有很多优势，比如核酸包封率高并且能够有效转染细胞，组织穿透性强，细胞毒性和免疫原性低，更有利于递送药物等优势，这些优势使lnp成为出色的核酸递送系统。脂质类材料作为体内可降解、生物相容性好的仿生材料，在递送药物方面有着巨大潜力，有望成为mrna疫苗的优选递送载体。首次构建基于cas13d系统，通过lnps包装递送至fapn小鼠体内，该系统能够敲降小鼠体内ctsb、ctsl的表达量，从而抑制猫冠状病毒感染
14、本专利技术还提供了所述的sgrna、所述的载体、所述的组合物或所述的药物在制备抑制猫冠状病毒的药物中的应用。
15、本专利技术公开了靶向ctsb、ctsl的sgrna，该系统可以有效敲降3t3细胞中的ctsb、ctsl表达，同时验证了ctsb、ctsl的敲降抑制了fcov的感染。通过lnps技术将cas13d系统递送到动物体内，其能在体内成功敲降，并对猫冠状病毒的感染起到一定的抑制作用，以期为fcov药物治疗和疫苗研发提供有力工具。
16、本专利技术的有益效果：
17、本专利技术设计并合成的基于ctsb、ctsl的sgrna，能够在3t3细胞内有效敲降，并抑制fcov的感染。通过lnps递送系统地送到fapn小鼠体内，最后验证了靶向ctsb、ctsl的cas13d系统对小鼠感染模型的免疫保护效果，以期成为治疗和预防fcov的候选mrna疫苗。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.基于CRISPR-Cas13d系统的靶向组织蛋白酶的sgRNA，其特征在于，所述组织蛋白酶为组织蛋白酶B和组织蛋白酶L，其中，靶向组织蛋白酶B的sgRNA序列如SEQ ID NO.1所示，靶向组织蛋白酶L的sgRNA序列如SEQ ID NO.2所示，
2.一种载体，包含编码权利要求1所述sgRNA的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，所述载体中还包含编码Cas13d核酸酶的核苷酸序列。
4.用于敲降组织蛋白酶的CRISPR-Cas1 3d系统，其特征在于，包含权利要求3所述的载体。
5.一种组合物，其特征在于，包括以下I～IV中至少一种：
6.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的sgRNA、权利要求2或3所述的载体、或者权利要求5所述的组合物。
7.一种药物，其特征在于，所述药物含有权利要求1所述的sgRNA、权利要求2或3所述的载体、或者权利要求5所述的组合物，以及药学上可接受的辅料。
8.权利要求1所述的sgRNA、权利要求2或3所述的载体、权利要求5所述的组合
...【技术特征摘要】
1.基于crispr-cas13d系统的靶向组织蛋白酶的sgrna，其特征在于，所述组织蛋白酶为组织蛋白酶b和组织蛋白酶l，其中，靶向组织蛋白酶b的sgrna序列如seq id no.1所示，靶向组织蛋白酶l的sgrna序列如seq id no.2所示，
2.一种载体，包含编码权利要求1所述sgrna的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，所述载体中还包含编码cas13d核酸酶的核苷酸序列。
4.用于敲降组织蛋白酶的crispr-cas1 3d系统，其特征在于，包含权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨永乐，黄耀伟，陈楚，王斌，
申请(专利权)人：湘湖实验室农业浙江省实验室，
类型：发明
国别省市：
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