【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及检验检测，具体为一种肉类食品中牛、猪、鸡、鸭源性成分的精准定量检测方法及应用。更具体地，本申请提供一种基于实时荧光pcr的牛肉食品中猪、鸡、鸭源性成分的精准定量检测方法及应用。
技术介绍
1、随着人类生活水平不断提高和对健康饮食的追求，人类的肉食消费结构逐渐发生变化，高蛋白、低脂肪、低胆固醇的牛羊肉的消费比例显著上升。
2、目前，肉类行业掺假的检测标准只有定性的检测方法，无法区分恶意掺假和无意污染，在肉类食品生产、运输、贮藏过程中，不同肉类相互接触、共用加工工具、共用生产线，而污染的肉类食品会被定义为“掺假肉”。牛肉食品中同时定量检测猪、鸡、鸭源性成分的方法未见报道。因此，急需建立一种稳定、准确、快速的定量检测方法，能精准定量牛肉食品中猪、鸡、鸭源性成分的含量，为执法部门提供更准确的检测结果，做到不错查、不漏查，促进肉类食品行业的健康发展。
技术实现思路
1、本专利技术的专利技术目的在于，提供一种肉类食品中牛、猪、鸡、鸭源性成分实时荧光pcr定量检测方法及应用。本专利技术方法可量化牛肉食品中猪、鸡、鸭源性成分的含量，区分恶意掺假和无意污染，打击肉源掺假，促进肉类食品行业的健康发展。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用技术方案如下：
3、一种肉类食品中牛、猪、鸡、鸭源性成分实时荧光pcr精准定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
4、(1)设计牛、猪、鸡、鸭标记基因的上游引物、下游引物及探针
5、(2)分别
6、(3)将步骤(2)提取的牛、猪、鸡、鸭标准物质dna进行稀释，分别配制一系列拷贝数浓度梯度的标准溶液，以标准溶液为模板进行实时荧光pcr扩增，测量每组标准溶液的ct值，绘制牛、猪、鸡、鸭标准曲线y＝ax+b，其中，y是测试样品的ct值，a是标准曲线的斜率，x是模板拷贝数以10为底数的对数，b是标准曲线的截距；
7、(4)以步骤(2)提取的测试样品的dna为模板，进行实时荧光pcr扩增；获得测试样品的ct值，根据步骤(3)中绘制的标准曲线，计算获得测试样品中牛、猪、鸡、鸭标记基因的拷贝数；
8、(5)根据公式计算测试样品中动物源性成分的百分含量，其中c是测试样品中待测动物成分的百分含量，nd是测试样品中待测动物标记基因拷贝数，nz是测试样品中所有动物标记基因拷贝数之和。
9、在一个实施方式中，步骤(3)和(4)中，所述实时荧光pcr的扩增引物和探针为：
10、牛的上游引物bos-f：ccctcgcccgcattg；
11、牛的下游引物bos-r：agcgacaggtcaagggagtca；
12、牛的探针bos-p：vic-cagctcaactcttagcc-bhq1；
13、猪的上游引物sus-f：gcaaggccagggatcga；
14、猪的下游引物sus-r：agcagaaaccagccatggatt；
15、猪的探针sus-p：fam-ccgcgtcctcatgg-bhq1；
16、鸡的上游引物gal-f：cgtccctcacttccatattgatg；
17、鸡的下游引物gal-r：atcttcactgtcaatgccttcaca；
18、鸡的探针gal-p：cy5-cctctttgtggatcctgt-bhq3；
19、鸭的上游引物ana-f：cagtcccccctgcctagga；
20、鸭的下游引物ana-r：tcagtgtacaggtagcccctctct；
21、鸭的探针ana-p：texas-aagtgccagtatgcggg-bhq2。
22、作为优选地，步骤(3)和(4)中，所述牛的实时荧光pcr反应体系为：qpcr taqmanprobe master mix 12.5μl，bos-f和bos-r引物各1.0μl，bos-p探针0.6μl，dna模板2μl，ddh2o补足25μl。
23、作为优选地，步骤(3)和(4)中，所述猪的实时荧光pcr反应体系为：qpcr taqmanprobe master mix 12.5μl，sus-f和sus-r引物各1.0μl，sus-p探针0.6μl，dna模板2μl，ddh2o补足25μl。
24、作为优选地，步骤(3)和(4)中，所述鸡的实时荧光pcr反应体系为：qpcr taqmanprobe master mix 12.5μl，gal-f和gal-r引物各1.0μl，gal-p探针0.6μl，dna模板2μl，ddh2o补足25μl。
25、作为优选地，步骤(3)和(4)中，所述鸭的实时荧光pcr反应体系为：qpcr taqmanprobe master mix 12.5μl，ana-f和ana-r引物各1.0μl，ana-p探针0.6μl，dna模板2μl，ddh2o补足25μl。
26、作为优选地，步骤(3)和(4)中，所述实时荧光pcr反应条件为：第一阶段95℃、5min；第二阶段95℃、10s，62℃、30s，循环数为40；在第二阶段的退火延伸时段收集荧光信号。
27、在一个实施方式中，本专利技术提供一种肉类食品中牛、猪、鸡、鸭源性成分实时荧光pcr定量检测方法的应用。
28、在一个实施方式中，本专利技术提供一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1-6中的引物和探针。
29、在一个实施方式中，所述权利要求1-6中的引物和探针在制备实时荧光pcr定量检测肉类食品中牛、猪、鸡、鸭源性成分的试剂盒中的用途。
30、综上，本专利技术以核基因组单拷贝基因为标记基因，建立的肉类食品中牛、猪、鸡、鸭源性成分的定量检测方法特异性高、准确度高、灵敏度高，其中牛、猪、鸡、鸭的定量限均为0.1％，检出限分别为5、5、5、10个拷贝。应用本专利技术方法对34份商业肉类食品的肉源成分进行定量检测，检测结果与标签标识进行比对，发现部分定性标识的牛肉产品中牛肉含量极低甚至不含有牛肉，且检出未标识的肉源成分；极少数定量标识的牛肉产品中牛肉含量没有达到标识含量。
31、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
32、1.本专利技术的标记基因为牛、猪、鸡、鸭核基因组单拷贝基因tumor necrosisfactor receptor superfamily member10a(tnfrsf10a)、prion protein(prnp)、transforming growth factor beta 3(tf-gb3)、beta-actin基因，核基因组单拷贝基因在动物细胞核中单一存在，标记基因拷贝数可代表动物细胞数。现有技术大多以线粒体基因为标记基因，动物细胞中线粒体的数量差异较大，以线粒体基因为标记基因建立的定量检测方法准确度较差。
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【技术保护点】
1.一种肉类食品中牛、猪、鸡、鸭源性成分实时荧光PCR精准定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)和(4)中，所述实时荧光PCR的扩增引物和探针为：
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)和(4)中，所述牛的实时荧光PCR反应体系为：qPCR TaqMan Probe Master Mix 12.5μL，Bos-F和Bos-R：引物各1.0μL，Bos-P探针0.6μL，DNA模板2μL，ddH2O补足25μL。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)和(4)中，所述猪的实时荧光PCR反应体系为：qPCR TaqMan Probe Master Mix 12.5μL，Sus-F和Sus-R引物各1.0μL，Sus-P探针0.6μL，DNA模板2μL，ddH2O补足25μL。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)和(4)中，所述鸡的实时荧光PCR反应体系为：qPCR TaqMan Probe Master Mix 12.5
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)和(4)中，所述鸭的实时荧光PCR反应体系为：qPCR TaqMan Probe Master Mix 12.5μL，Ana-F和Ana-R引物各1.0μL，Ana-P探针0.6μL，DNA模板2μL，ddH2O补足25μL。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)和(4)中，所述实时荧光PCR反应条件为：第一阶段95℃、5min；第二阶段95℃、10s，62℃、30s，循环数为40；在第二阶段的退火延伸时段收集荧光信号。
8.权利要求1所述方法在肉类食品中牛、猪、鸡、鸭源性成分实时荧光PCR定量检测中的应用。
9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1-6中的引物和探针。
10.所述权利要求1-6中的引物和探针在制备实时荧光PCR定量检测肉类食品中牛、猪、鸡、鸭源性成分的试剂盒中的用途。
...【技术特征摘要】
1.一种肉类食品中牛、猪、鸡、鸭源性成分实时荧光pcr精准定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)和(4)中，所述实时荧光pcr的扩增引物和探针为：
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)和(4)中，所述牛的实时荧光pcr反应体系为：qpcr taqman probe master mix 12.5μl，bos-f和bos-r：引物各1.0μl，bos-p探针0.6μl，dna模板2μl，ddh2o补足25μl。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)和(4)中，所述猪的实时荧光pcr反应体系为：qpcr taqman probe master mix 12.5μl，sus-f和sus-r引物各1.0μl，sus-p探针0.6μl，dna模板2μl，ddh2o补足25μl。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)和(4)中，所述鸡的实时荧光pcr反应体系为：qpcr taqman probe master...
【专利技术属性】
技术研发人员：常丽娟，黄平，付成平，李源洪，王思，刘泳伶，隆艾琳，
申请(专利权)人：四川省农业科学院遥感与数字农业研究所成都农业遥感分中心，
类型：发明
国别省市：
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