【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物病理学、基因组学、分子生物学、分子遗传学和水稻抗病育种，具体涉及用于水稻抗稻瘟病基因的功能标记检测，尤其涉及一种鉴定piz座位系列等位的功能标记组方法。
技术介绍
1、目前，水稻是世界上非常重要的粮食作物之一。由稻瘟菌(magnap rthe grisea)引发的水稻稻瘟病是迄今为止世界上最具有杀伤力的水稻病害，全世界因水稻稻瘟病造成的水稻每年平均减少产量约10～30％，严重时达40～50％，更甚的是颗粒无收。到今天为止，这种病在生产上还不能完全得到适当的控制伴随着温室效应加剧全球气候开始变暖，水稻稻瘟病害的爆发向不可收拾的趋势发展，数据结果表明，2010年稻瘟病发病面积达6000km2，2014年是中国稻瘟病发病最严重的一年，高达58000km2；2019年发病面积达3333km2，为此有效预防水稻稻瘟病的发生，把稻瘟病造成的损失降到最低是水稻生产最重要任务之一，因此筛选抗稻瘟病的优良品种非常重要。目前关于稻瘟病抗性品种的筛选主要是进行人工接种鉴定或自然诱发鉴定，方法原始，机制不够明确，人工接种的方法进行稻瘟病抗性鉴定，鉴定的周期比较长，病原菌生理小种滞后，利用自然诱发鉴定方法又存在病原菌分布不均匀，年度间抗性差异大等问题。所以利用分子标记辅助选择的方法提高品种的稻瘟病抗性有重要的应用价值。
2、目前已经克隆多个水稻抗稻瘟病基因，如pizt、pi9、pigm、pi2、pik、pi21、pi54等。稻瘟病抗性基因的克隆为稻瘟病的分子标记辅助育种提供了重要的基础，促进了稻瘟病抗性品种的培育从基于人工表
3、piz座位的抗性基因是目前在育种中应用效果较好的抗性基因座。该座位包含7个抗性等位基因，即pizt、pi9、pigm、pi2。这些抗性基因有不同的抗性效应，有的抗性等位基因已经失去了育种应用价值。所以准确的鉴定不同的抗性等位基因有重要的育种应用价值。
4、已经有专利和文章报道过piz座位抗性基因的分子标记鉴定方法，但这些分子标记大都只考虑了抗病品种和感病品种pik基因间的序列差异，但并不能区分不同抗性等位基因间的差异。具体而言，目前鉴定pigm、pi9和pi2/pizt的indel标记方法不能区分抗性等位基因pi2和pizt；indel标记方法需要利用凝胶电泳的方法来检测多态，适合少量样品的分子标记分析，不适合大量样品的自动化高通量的检测。同时，现有的indel标记方法不能反映任何功能信息。
5、通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
6、1)目前关于稻瘟病抗性品种的筛选方法原始，机制不够明确；利用人工接种方法进行稻瘟病抗性鉴定，鉴定周期比较长，病原菌生理小种滞后；利用自然诱发鉴定方法存在病原菌分布不均匀、年度间抗性差异大等问题。
7、(2)目前关于piz座位抗性基因的分子标记鉴定方法大都只考虑抗病品种和感病品种pik基因间的序列差异，并不能区分不同抗性等位基因间的差异。
8、(3)目前鉴定pigm、pi9和pi2/pizt的indel标记方法不能区分抗性等位基因pi2和pizt；利用凝胶电泳的方法检测多态，适合少量样品的分子标记分析，不适合大量样品的自动化高通量的检测，同时不能反映任何功能信息。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种鉴定piz座位系列等位的功能标记组方法，尤其涉及一种鉴定水稻piz座位多个稻瘟病抗性等位基因的功能标记组及其应用。
2、本专利技术是这样实现的，一种鉴定piz座位系列等位的功能标记组方法，鉴定piz座位系列等位的功能标记组方法包括：选择piz座位的等位基因外显子cds2作为分子标记开发的靶标序列；根据靶标序列在不同抗病等位基因以及感病基因间进行多序列比对，筛选用于区分pik座位不同抗性等位基因的snp位点；根据snp位点序列设计kasp标记引物，开发用于pik座位抗感基因区分以及不同抗性等位基因区分的功能标记组，利用功能标记组区分不同抗性等位基因。
3、进一步，鉴定piz座位系列等位的功能标记组方法包括以下步骤：
4、步骤一，分子标记开发靶标序列的选择；
5、步骤二，靶标序列变异分析；
6、步骤三，特征snp的kasp功能标记开发；
7、步骤四，基于功能标记组的基因型鉴定。
8、进一步，步骤一中的分子标记开发靶标序列的选择包括：
9、不同的抗病等位基因序列为pi2、pi9、pigm和pizt，以相应的日本晴等位基因作为感病等位基因的对照。piz座位的等位基因包括3个外显子cds1、cds2和cds3，优先选择编码区作为分子标记开发的靶标序列；分别用3个外显子cds1、cds2和cds3的序列和已知的水稻基因组进行序列比对，获得不同品种piz座位的同源基因，选择cds2作为分子标记开发的靶标序列。
10、进一步，步骤二中的靶标序列变异分析包括：
11、利用pigm、pizt、pi2、pi9以及感病等位基因日本晴的cds2序列进行多序列比对，确定不同等位基因的编码区变异。
12、进一步，步骤三中的特征snp的kasp功能标记开发包括：
13、根据靶标序列比对结果筛选出用于鉴定不同抗性等位基因的snp位点；取snp位点侧翼200bp的序列进行kasp标记引物设计，最终获得用于pik座位不同等位基因鉴定的功能标记组。
14、进一步，用于pik座位不同等位基因鉴定的功能标记组的引物序列如下：
15、引物piz-521rt的核苷酸序列为seq id no:1，引物piz-521rc的核苷酸序列为seqid no:2，引物piz-521rg的核苷酸序列为seq id no:3，引物piz-521f的核苷酸序列为seqid no:4，引物piz-273ft的核苷酸序列为seq id no:5，引物piz-273fg的核苷酸序列为seqid no:6，引物piz-273r的核苷酸序列为seq id no:7，引物pigm-375ra的核苷酸序列为seqid no:8，引物pigm-375rc的核苷酸序列为seq id no:9，引物pigm-375f的核苷酸序列为seq id no:10，引物pi9-440fc的核苷酸序列为seq id no:11，引物pi9-440ft的核苷酸序列为seq id no:12，引物pi9-440r的核苷酸序列为seq id no:13。
16、进一步，步骤四中的基于功能标记组的基因型鉴定包括：
17、(1)取水稻叶片利用ctab或其它dna提取方法进行dna提取；
18、(2)pcr扩增以及pcr产物检测：合成功能标记组中的引物后，进行pcr扩增；其中，扩增条件为10μl的体系，含1.0μl 10×parms buffer，1.0μl dntp，3种引物各1.0μl4mol·l-1，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种鉴定Piz座位系列等位的功能标记组方法，其特征在于，鉴定Piz座位系列等位的功能标记组方法包括：选择Piz座位的等位基因外显子cds2作为分子标记开发的靶标序列；根据靶标序列在不同抗病等位基因以及感病基因间进行多序列比对，筛选用于区分Pik座位不同抗性等位基因的SNP位点；根据SNP位点序列设计KASP标记引物，开发用于Pik座位抗感基因区分以及不同抗性等位基因区分的功能标记组，利用功能标记组区分不同的抗性等位基因。
2.如权利要求1所述鉴定Piz座位系列等位的功能标记组方法，其特征在于，鉴定Piz座位系列等位的功能标记组方法包括以下步骤：
3.如权利要求2所述鉴定Piz座位系列等位的功能标记组方法，其特征在于，步骤一中的分子标记开发靶标序列的选择包括：
4.如权利要求2所述鉴定Piz座位系列等位的功能标记组方法，其特征在于，步骤二中的靶标序列变异分析包括：
5.如权利要求2所述鉴定Piz座位系列等位的功能标记组方法，其特征在于，步骤三中的特征SNP的KASP功能标记开发包括：
6.如权利要求5所述鉴定Piz座位
7.如权利要求2所述鉴定Piz座位系列等位的功能标记组方法，其特征在于，步骤四中的基于功能标记组的基因型鉴定包括：
8.一种实施如权利要求1～7任意一项所述鉴定Piz座位系列等位的功能标记组方法得到的鉴定Piz座位系列等位的功能标记组，其特征在于，鉴定Piz座位系列等位的功能标记组包括Pizt、Pi2、Pi9、Pigm、S以及感病等位基因；其中，Pizt的alm-273为TG，alm-521为AGGCGGC，alm-440为T，alm-375为GGAATG；Pi2的alm-273为CT，alm-521为AGGCGGC，alm-440为T，alm-375为GGAATG；Pi9的alm-273为CT，alm-521为CTCTTGC，alm-440为C，alm-375为GGAATG；Pigm的alm-273为CT，alm-521为AGGCAGC，alm-440为T，alm-375为ATAATT；S的alm-273为CT，alm-521为AGGCAGC，alm-440为T，alm-375为GGAATG。
9.一种适合大量样品自动化检测的分子标记，其特征在于，适合大量样品自动化检测的分子标记包含如权利要求8所述鉴定Piz座位系列等位的功能标记组。
10.一种基于基因编码区的分子标记，其特征在于，基于基因编码区的分子标记包含如权利要求8所述鉴定Piz座位系列等位的功能标记组。
...【技术特征摘要】
1.一种鉴定piz座位系列等位的功能标记组方法，其特征在于，鉴定piz座位系列等位的功能标记组方法包括：选择piz座位的等位基因外显子cds2作为分子标记开发的靶标序列；根据靶标序列在不同抗病等位基因以及感病基因间进行多序列比对，筛选用于区分pik座位不同抗性等位基因的snp位点；根据snp位点序列设计kasp标记引物，开发用于pik座位抗感基因区分以及不同抗性等位基因区分的功能标记组，利用功能标记组区分不同的抗性等位基因。
2.如权利要求1所述鉴定piz座位系列等位的功能标记组方法，其特征在于，鉴定piz座位系列等位的功能标记组方法包括以下步骤：
3.如权利要求2所述鉴定piz座位系列等位的功能标记组方法，其特征在于，步骤一中的分子标记开发靶标序列的选择包括：
4.如权利要求2所述鉴定piz座位系列等位的功能标记组方法，其特征在于，步骤二中的靶标序列变异分析包括：
5.如权利要求2所述鉴定piz座位系列等位的功能标记组方法，其特征在于，步骤三中的特征snp的kasp功能标记开发包括：
6.如权利要求5所述鉴定piz座位系列等位的功能标记组方法，其特征在于，用于pik座位不同等位基因鉴定的功能标记组的引物序列如下：
7.如权利要求2所述鉴定piz座位系列等位的功能标记组方法...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨秀荣，闫双勇，李月娇，孙淑琴，李广胜，
申请(专利权)人：天津市农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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