【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及芬太尼检测，特别是芬太尼检测试纸条制备工艺。
技术介绍
1、芬太尼(c21h32n6o3，fentanyl)，化学名为n-[1-(2-苯乙基)-4-哌啶基]-n-苯基-丙酰胺，，常以枸橼酸盐形式存在，其枸橼酸盐外观为白色结晶粉末，味苦，亲水性好，水溶液呈酸性，易溶于热异丙醇，溶于甲醇，略溶于水或氯仿，其类物质易被皮肤吸收，是janssen博士等人于1960年首次合成，作为镇痛剂于1963年在欧洲获准临床应用，并于1968年在美国上市。临床上主要用于癌症患者的麻醉和镇痛，可以通过注射、鼻嗅、口服及片剂使用，贴片也可切成碎片，放在舌下或者颊腔中使用。
2、
3、现阶段，芬太尼的检测手段主要是以仪器分析和免疫分析技术为主，其中仪器分析主要包括高效液相色谱法(hplc)、气相色谱-质谱法(gm-ms)、超高效液相色谱串联质谱法(lc-ms)、拉曼光谱法、红外光谱法等。虽然仪器分析具有准确、政府和社会认可度高等优势，但是仪器分析由于分析设备价格高昂、技术操作要求高、需要专业技术人员操作、分析周期长、样品前处理过程复杂等特点，无法实现在基层和现场的快速检测和推广的目的。免疫分析具有灵敏度高、特异性强、样品检测高通量、操作简便和可现场检测等优势，目前已得到广泛的应用。
4、近年来，随着不断加大毒品的管制力度，传统毒品和合成毒品的滥用已基本得到控制，而新精神活性物质因绝大多数未被列管，滥用情况严重。但在临床方面，芬太尼类物质如舒芬太尼、瑞芬太尼、阿芬太尼等又常被用来做麻醉剂和镇痛剂，如何有效的使
5、因此加强芬太尼的监管力度，尤其在检测方面，要开展芬太尼的检测技术研究和应用，开发高灵敏度、准确、快速的检测技术对于保证人们生命安全和社会安定具有重要意义。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于，提供芬太尼检测试纸条制备工艺。本专利技术提供一种用于芬太尼残留快速检测的试纸条，具有很好的准确性和精密度的优点，为监管部门及检测机构提供了一种适用于现场快速检测的手段。
2、本专利技术的技术方案：芬太尼检测试纸条制备工艺，包括如下流程：
3、a、制备准备：准备制备用的材料和仪器，并配制溶液；所述材料包括1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(edc)、n-基硫代墟拍酞亚胺(nhs)、2-(n-吗啉)乙磺酸(mes)、羊抗鼠二抗(igg)、牛血清γ球蛋白(bgg)、荧光纳米微球、硝酸纤维素膜(nc膜)、结合垫和吸水垫；
4、所述溶液包括0.05mol/l mes缓冲液、标记封闭液、标记洗涤液、0.02mol/lpb缓冲液、微球活化剂和微球复溶保护液；
5、b、荧光探针的制备：采用edc-nhs两步法进行羧基与抗体的偶联；
6、c、试纸条的制备：处理样品垫和结合垫；
7、d、组装试纸条：将样品垫、结合垫和吸水垫组装在pvc底板并卡壳完成组装。
8、前述的芬太尼检测试纸条制备工艺中，所述荧光纳米微球采用粒径为100nm-300nm，固含量为1％，标记物为eu3+的荧光微球。
9、前述的芬太尼检测试纸条制备工艺中，所述荧光纳米微球采用粒径为100nm、200nm和300nm，固含量为1％，标记物为eu3+的荧光微球。
10、前述的芬太尼检测试纸条制备工艺中，所述荧光纳米微球采用粒径为300nm，固含量为1％，标记物为eu3+的荧光微球。
11、前述的芬太尼检测试纸条制备工艺中，所述mes缓冲液(荧光标记缓冲液)的ph为6.0-8.0。
12、前述的芬太尼检测试纸条制备工艺中，所述mes缓冲液(荧光标记缓冲液)的ph为6.0、6.5、7.0、7.5和8.0。
13、前述的芬太尼检测试纸条制备工艺中，所述mes缓冲液(荧光标记缓冲液)的ph为6.0。
14、前述的芬太尼检测试纸条制备工艺中，步骤b所述的荧光探针的制备，其具体步骤如下：
15、b1、清洗微球：将固含量1％的荧光纳米微球超声2min并摇匀，取100μl于2ml离心管中，13000rpm，4℃，离心10min；弃上清，加入400μl mes缓冲液，再次超声混匀后离心，重复此步骤1次；除去上清，加入800μl mes缓冲液，超声均匀，得b1品；
16、b2、羧基活化：b1品中加入45μl浓度为100mg/ml的nhs溶液，混匀；加入25μl浓度为100mg/ml的edc溶液，混匀；避光室温孵育30min，13000rpm，4℃，离心10min，弃上清，加入1ml mes缓冲液重悬沉淀，超声均匀，得b2品；
17、b3、蛋白偶联：加入100μg芬太尼单克隆抗体于活化好的1mlb2品中，旋涡混匀，反应1～2min后，超声30s，室温避光旋转反应2h，得b3品；
18、b4、微球封闭：b3品超声30s后，再加入25μl质量比为15％的bsa封闭液，旋涡混匀，室温避光旋转反应1h后，13000rpm，4℃，离心10min，弃上清，除去未偶联的抗体，加入100μl微球复溶保护液，超声2min重悬沉淀后于4℃避光保存。
19、前述的芬太尼检测试纸条制备工艺中，步骤c所述的试纸条的制备，其具体步骤如下：
20、c1、样品垫处理：芬太尼免疫抗原(fentanly-bsa)稀释为0.4mg/ml，将羊抗鼠二抗稀释为0.8mg/ml；将nc膜贴于pvc底板对应位置上，分别用低浓度盐酸、氢氧化钠溶液及纯水依次清洗喷金划膜仪，设置划膜参数，将稀释的芬太尼免疫抗原(fentanly-bsa)和羊抗鼠二抗倒吸于仪器相对应的导管中，在层析板上划下包被量为1μl/cm，间距为8mm的检测线(t)和质控线(c)，37℃烘箱过夜；
21、c2、结合垫处理：用切条机将结合垫切割成50mm×300mm尺寸，用结合垫处理液浸泡完全，取出平铺于网架，37℃烘箱过夜；
22、取4μl已经偶联好抗体蛋白的荧光纳米微球添加于95μl稀释缓冲液中，再加入1μl溴甲酚酯荧光溶液，震荡混合均匀后，倒吸入喷金划膜仪，设置参数，喷量2μl/cm，将处理完成的荧光-抗体蛋白溶液喷涂于烘干后的结合垫上，37℃烘干2h。
23、前述的芬太尼检测试纸条制备工艺中，步骤d所述的组装试纸条，其具体内容如下：
24、将样品垫、结合垫以及吸水垫分别粘贴于已粘有烘干的nc膜的pvc底板上，结合垫与样品垫、nc膜分别重叠1-2mm；
25、使用切条机将粘好的pvc底板切割成适应卡壳需要宽度的免疫层析试纸条，进行卡壳组装，放入装有干燥剂的密封袋中保存于4℃避光环境。
26、前述的芬太尼检测试纸条制备工艺中，所述检测线(t)的包被量为0.4mg/ml，所述质控线(c)的包被量为0.05mg/ml-0.4mg/ml。
27、前述的芬太尼检测试纸条制备工艺中，所述质控线(c)的包被量为0本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.芬太尼检测试纸条制备工艺，其特征在于,包括如下流程：
2.根据权利要求1所述的芬太尼检测试纸条制备工艺，其特征在于：所述荧光纳米微球采用粒径为100nm-300nm，固含量为1％，标记物为Eu3+的荧光微球。
3.根据权利要求1所述的芬太尼检测试纸条制备工艺，其特征在于：所述MES缓冲液的pH为6.0-8.0。
4.根据权利要求1所述的芬太尼检测试纸条制备工艺，其特征在于，步骤B所述的荧光探针的制备，其具体步骤如下：
5.根据权利要求1所述的芬太尼检测试纸条制备工艺，其特征在于，步骤C所述的试纸条的制备，其具体步骤如下：
6.根据权利要求1所述的芬太尼检测试纸条制备工艺，其特征在于，步骤D所述的组装试纸条，其具体内容如下：
7.根据权利要求5所述的芬太尼检测试纸条制备工艺，其特征在于：所述检测线(T)的包被量为0.4mg/ml，所述质控线(C)的包被量为0.05mg/ml-0.4mg/ml。
8.根据权利要求7所述的芬太尼检测试纸条制备工艺，其特征在于：所述质控线(C)的包被量为0.2mg/m
9.根据权利要求5所述的芬太尼检测试纸条制备工艺，其特征在于：所述已经偶联好抗体蛋白的荧光纳米微球的添加量为20μg-100μg。
10.根据权利要求9所述的芬太尼检测试纸条制备工艺，其特征在于：所述已经偶联好抗体蛋白的荧光纳米微球的添加量为60μg。
...【技术特征摘要】
1.芬太尼检测试纸条制备工艺，其特征在于,包括如下流程：
2.根据权利要求1所述的芬太尼检测试纸条制备工艺，其特征在于：所述荧光纳米微球采用粒径为100nm-300nm，固含量为1％，标记物为eu3+的荧光微球。
3.根据权利要求1所述的芬太尼检测试纸条制备工艺，其特征在于：所述mes缓冲液的ph为6.0-8.0。
4.根据权利要求1所述的芬太尼检测试纸条制备工艺，其特征在于，步骤b所述的荧光探针的制备，其具体步骤如下：
5.根据权利要求1所述的芬太尼检测试纸条制备工艺，其特征在于，步骤c所述的试纸条的制备，其具体步骤如下：
6.根据权利要求1所述的芬太尼检测试纸条制备工...
【专利技术属性】
技术研发人员：金仁耀，宋虹，李因来，杨加成，朱晓楠，宋妍灵，刘晓霞，
申请(专利权)人：浙江工商大学，
类型：发明
国别省市：
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