【技术实现步骤摘要】
一、本专利技术涉及生物医药领域，特别是一种基于肺炎链球菌的生物杂合自由基发生器的制备方法及应用。
技术介绍
0、二、
技术介绍
1、活性氧(ros)是具有高化学反应性的含氧生物活性物质，可通过诱导脂质过氧化或损伤蛋白质和dna诱导细胞死亡。由于肿瘤细胞对外源ros更加敏感，比正常细胞更容易受到外源ros的损伤，广泛的研究努力已经指向ros生成系统的设计以用于肿瘤治疗。然而，尽管肿瘤细胞与正常细胞相比具有更高的过氧化氢(h2o2)水平(50-100μm)，但内源性h2o2仍然不足以持续产生大量ros，实现令人满意的抗肿瘤效果。因此，迫切需要开发一种能在肿瘤组织内选择性高效持续产生ros的范式。
2、值得注意的是，细菌感染过程中会产生大量ros，高浓度的ros积累会对宿主细胞造成严重损伤。尤其是，肺炎链球菌感染时会产生大量h2o2，由于缺乏过氧化氢酶来中和h2o2，使得h2o2产量可累积达毫摩尔，这为肺炎链球菌用于抗肿瘤治疗提供了新思路。此外，对缺氧部位的感应和趋化能力以及肿瘤免疫抑制微环境使细菌能够选择性在肿瘤组织中高效定植。因此，利用肺炎链球菌优异的肿瘤靶向性和高效的h2o2产生效率有望用于高效的抗肿瘤治疗。基于此，我们对肺炎链球菌的肿瘤杀伤效果进行了初步探索。然而，由于h2o2氧化活性弱造成肿瘤治疗效果不佳。因此，肺炎链球菌产生的h2o2转变为高活性的羟基自由基(·oh)有望提高肺炎链球菌介导的抗肿瘤效果。
3、近年来，细菌与功能性纳米颗粒结合，纳米材料修饰可以显著扩展细菌的功能。研究表明，四
技术实现思路
0、三、
技术实现思路
1、针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本专利技术之目的就是提供一种基于肺炎链球菌的生物杂合自由基发生器的制备方法及应用，可不受肿瘤乏氧限制持续产生高活性的·oh高效杀伤肿瘤。
2、本专利技术解决的技术方案是，提供一种基于肺炎链球菌的生物杂合自由基发生器的制备方法，首先分别在s.pn(肺炎链球菌)和fe3o4表面修饰叠氮基团n3和dbco(二苯并环辛炔)，通过n3与dbco的炔基发生点击化学反应，即得生物杂合自由基发生器，具体包括以下步骤：
3、1)制备叠氮修饰的肺炎链球菌s.pn-n3
4、培养s.pn8-10h，用新鲜配置的thb培养基+5％胎牛血清扩大培养10倍，培养3-5h，培养结束后，6000g离心5-10min收集细胞，并重悬于含有4-6mm h-d-dap(n3)·hcl的新鲜thb培养基或新鲜thb培养基+5％胎牛血清中继续培养60-80min，然后6000g离心5-10min收集细胞，并用pbs缓冲液洗涤细胞2次，得叠氮修饰的肺炎链球菌s.pn-n3；
5、2)制备炔基修饰的fe3o4纳米颗粒fe3o4-dbco
6、将10-40mg dspe-peg2000-dbco(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-二苯基环辛炔)溶解于2-8ml氯仿中，超声5-10min，然后转移到干燥的玻璃圆底烧瓶中；随后，将5-20mg油酸包覆的fe3o4纳米粒溶于1-4ml氯仿，将fe3o4溶液加入dspe-peg2000-dbco溶液中，超声混合5-10min后将上述玻璃圆底烧瓶55℃旋蒸至溶剂完全蒸干，加入5-20ml超纯水超声20-30min，获得fe3o4-dbco纳米粒；
7、3)制备基于肺炎链球菌的生物杂合自由基发生器fe3o4@s.pn
8、将步骤1)制备的s.pn-n3细胞重悬于步骤2)制备的3-12ml浓度为50-200μg/ml的fe3o4-dbco制剂体系中孵育3-5h，随后，取200μl生物正交后的菌液，4000rpm，4℃，离心3-5min，弃去上清，pbs洗涤2次后重悬于3-12ml pbs中，得基于肺炎链球菌的生物杂合自由基发生器。
9、所述的步骤1)中s.pn-n3的粒径为0.5-1μm，步骤2)中fe3o4-dbco纳米粒的粒径为10-30nm，步骤3)中fe3o4@s.pn的粒径为0.5-1μm。
10、所述的thb培养基配方为：牛肉粉10g/l、胰蛋白胨20g/l、葡萄糖2g/l、碳酸氢钠2g/l、氯化钠2g/l、磷酸氢二钠0.4g/l，ph值7.8±0.1，25℃。
11、所述的基于肺炎链球菌的生物杂合自由基发生器在制备抗肿瘤药物注射剂中的应用。
12、所述的基于肺炎链球菌的生物杂合自由基发生器在自供给h2o2提高肿瘤化学动力学治疗药物中的应用。
13、所述的基于肺炎链球菌的生物杂合自由基发生器在乏氧肿瘤治疗药物中的应用。
14、所述的基于肺炎链球菌的生物杂合自由基发生器在利用细菌天然感染途径诱导肿瘤细胞死亡药物中的应用。
15、本专利技术方法操作方便，稳定可靠，所制得的肿瘤生物杂合自由基发生器具有选择性高、持续高效等优势，在肿瘤治疗方面可突破肿瘤乏氧微环境限制选择性持续产生高活性·oh，提高肿瘤治疗效果，是肿瘤治疗药物上的创新，经济和社会效益巨大。
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1. 一种基于肺炎链球菌的生物杂合自由基发生器的制备方法，其特征在于，首先分别在S.pn和Fe3O4表面修饰叠氮基团N3和DBCO，通过N3与DBCO的炔基发生点击化学反应，即得生物杂合自由基发生器，具体包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于肺炎链球菌的生物杂合自由基发生器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述的基于肺炎链球菌的生物杂合自由基发生器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求1所述的基于肺炎链球菌的生物杂合自由基发生器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
5. 根据权利要求1所述的基于肺炎链球菌的生物杂合自由基发生器的制备方法，其特征在于，所述的步骤1）中S.pn-N3的粒径为0.5-1μm，步骤2）中Fe3O4-DBCO纳米粒的粒径为10-30 nm，步骤3）中Fe3O4@S.pn的粒径为0.5-1μm。
6.根据权利要求1所述的基于肺炎链球菌的生物杂合自由基发生器的制备方法，其特征在于，所述的THB培养基配方为：牛肉粉10g/L、胰蛋白胨20g/L、葡萄糖2
7.权利要求1-4任一项所述的基于肺炎链球菌的生物杂合自由基发生器在制备抗肿瘤药物注射剂中的应用。
8.权利要求1-4任一项所述的基于肺炎链球菌的生物杂合自由基发生器在自供给H2O2提高肿瘤化学动力学治疗药物中的应用。
9.权利要求1-4任一项所述的基于肺炎链球菌的生物杂合自由基发生器在乏氧肿瘤治疗药物中的应用。
10.权利要求1-4任一项所述的基于肺炎链球菌的生物杂合自由基发生器在利用细菌天然感染途径诱导肿瘤细胞死亡药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1. 一种基于肺炎链球菌的生物杂合自由基发生器的制备方法，其特征在于，首先分别在s.pn和fe3o4表面修饰叠氮基团n3和dbco，通过n3与dbco的炔基发生点击化学反应，即得生物杂合自由基发生器，具体包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于肺炎链球菌的生物杂合自由基发生器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述的基于肺炎链球菌的生物杂合自由基发生器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求1所述的基于肺炎链球菌的生物杂合自由基发生器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
5. 根据权利要求1所述的基于肺炎链球菌的生物杂合自由基发生器的制备方法，其特征在于，所述的步骤1）中s.pn-n3的粒径为0.5-1μm，步骤2）中fe3o4-dbco纳米粒的粒径为10-30 nm，步骤3）中fe3o...
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