【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药研究开发领域，具体涉及一种重组ulp1融合蛋白酶及其制备方法。
技术介绍
1、融合表达技术是制备重组多肽和蛋白的常用技术，引入标签蛋白进行融合表达可以起到防止目的蛋白或多肽被降解、屏蔽外源蛋白对宿主的毒性作用、提高表达产量和促进目的蛋白正确折叠等重要作用。在生产工艺中，标签蛋白可被与之匹配的工具蛋白酶移除，以获得目的蛋白或多肽。
2、在常用的标签蛋白中，sumo标签-ulp1酶系统由于具有独特的优势，被越来越多地用于融合蛋白的重组表达(malakhov michael p,et al.journal of structural andfunctional genomics,5(1-2),pp.75-86(2004))。sumo蛋白本身具有良好的溶解性，可显著促进目的蛋白以可溶形式表达，简化下游提取纯化工艺。相比于谷胱甘肽转移酶、硫氧还蛋白、绿色荧光蛋白、麦芽糖结合蛋白等融合标签，sumo蛋白的分子量较小，在融合蛋白中占比小，可提高目的蛋白相比比率，有利于提升生产效率(panavas tadas,sanderscarsten and butt tauseef r.methods in molecular biology(clifton,n.j.)497(2009):303-17)。
3、更重要的是，移除sumo标签所用的工具酶ulp1识别的是sumo蛋白的三维结构，而非一般蛋白酶所识别的部分肽段一级序列。因此，ulp1酶具有极高的特异性。其次，ulp1酶的酶切位点位于sumo标签蛋白的
4、全长ulp1酶由621个残基组成，其催化结构域位于c端218aa，即 ulp1(404-621)(缪语,et al.上海交通大学学报(医学版)v.34, no.252.11(2014):1683-1687)。目前文献报道的及商业化的ulp1蛋白酶几乎均为通过大肠杆菌重组表达的ulp1(404-621)蛋白，表达产量介于20～355mg/l发酵液之间(陈兴华,et al.中国生物工程杂志,no.179.03(2007):34-41；李诗洁,et al.中国生物工程杂志v.38,no.312.03(2018):51-61；冯秀萍,et al.中国生物工程杂志v.29,no.203.02(2009):81-86)。
5、但重组ulp1蛋白酶的分离纯化面临诸多挑战，传统纯化手段收率较低，限制了其作为工具酶在重组蛋白和重组多肽类药物制备中的应用。已有文献报道重组ulp1的下游纯化工艺多采用ni柱亲和层析(陈兴华,et al.出处同上；李诗洁,et al.出处同上)。由于ni填料价格昂贵、载样量衰减快、且存在镍离子脱落导致潜在毒性等问题，该方法通常难以实现大规模工业化生产。
6、protein a(蛋白a)是金黄色葡萄球菌的一种膜蛋白。s1蛋白是基于protein a蛋白b结构域的突变体。主要是把序列中的碱性氨基酸突变成其它氨基酸，达到降低等电点(pi)的目的。s1蛋白作为标签蛋白与其它蛋白融合表达时，具有助溶、提高表达量、辅助蛋白折叠、保持蛋白稳定性等特点。
7、因此，本领域亟需开发出一种以融合蛋白的形式表达的ulp1蛋白酶，以实现对催化活性不产生显著影响且降低纯化难度，具有重要的应用价值。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种高活力重组ulp1融合蛋白。
2、本专利技术的另一目的是提供重组ulp1融合蛋白的制备方法。
3、在本专利技术的第一方面，提供了一种重组ulp1融合蛋白酶，所述融合蛋白酶具有式i所示的结构：
4、(z1)n-l1-ulp1-l2-(z1)m(i)
5、其中，
6、z1为单体肽元件；
7、n为0、1、2或3；
8、m为0、1、2或3；
9、2≤m+n≥4；
10、l1和l2各自独立为：无或(z3-z4)q；
11、其中，q为1或2时，z3为无或连接肽，z4为无或酶切位点，且z3和 z4不同时为无；
12、(z1)n和/或(z1)m为多聚体时，各单体肽元件之间可以有或无间隔元件 (1-5aa)；
13、“-”表示连接上述各元件的肽键。
14、在另一优选例中，所述融合蛋白酶特异性识别和切割sumo融合标签。
15、在另一优选例中，所述z1各自独立选自下组：
16、(a)如seq id no:2所示的氨基酸序列；
17、(b)与seq id no:2所示氨基酸序列≥80％同源性(较佳地≥85％，更佳地≥90％，更佳地≥95％，最佳地≥97％的同源性)且保留所述可特异性识别和切割sumo融合标签的多肽；
18、(c)将seq id no:2所示氨基酸序列经过1-3个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留所述可特异性识别和切割sumo融合标签的衍生多肽。
19、在另一优选例中，所述ulp1的氨基酸序列如seq id no:1所示。
20、在另一优选例中，所述连接肽部分由1～50个aa构成，可包含中性或带正电荷或带负电荷的氨基酸残基。
21、在另一优选例中，所述z4含有酶切位点，所述的酶切位点的氨基酸序列如seq idno:6所示。
22、在另一优选例中，所述融合蛋白酶的氨基酸序列如seq id no:7所示。
23、在另一优选例中，所述融合蛋白酶的等电点pi≥4且≤6，较佳地<5.5，最佳地<5。
24、在本专利技术的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本专利技术第一方面所述的融合蛋白酶。
25、在本专利技术的第三方面，提供了一种表达载体，所述表达载体包括本专利技术第二方面所述的多核苷酸。
26、在另一优选例中，所述的表达载体选自下组：dna、rna、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、或其组合。
27、在另一优选例中，所述的表达载体是pet28a。
28、在本专利技术的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本专利技术第三方面所述的载体，或染色体中整合有外源的本专利技术第二方面所述的多核苷酸，或表达本专利技术第一方面所述的融合蛋白酶。
29、在另一优选例中，所述的宿主细胞选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组Ulp1融合蛋白酶，其特征在于，所述融合蛋白酶具有式I所示的结构：
2.如权利要求1所述的融合蛋白酶，其特征在于，所述融合蛋白酶特异性识别和切割SUMO融合标签。
3.如权利要求1所述的融合蛋白酶，其特征在于，所述Z1各自独立选自下组：
4.如权利要求1所述的融合蛋白酶，其特征在于，所述融合蛋白酶的氨基酸序列如SEQID NO:7所示。
5.如权利要求1所述的融合蛋白酶，其特征在于，所述融合蛋白酶的等电点PI≥4且≤6，较佳地<5.5，最佳地<5。
6.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求1所述的融合蛋白酶。
7.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如权利要求6所述的多核苷酸。
8.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有如权利要求7所述的载体，或染色体中整合有外源的如权利要求6所述的多核苷酸，或表达如权利要求1所述的融合蛋白酶。
9.一种制备如权利要求1所述的重组Ulp1融合蛋白酶的方法，其特征在于，包括步骤：
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...【技术特征摘要】
1.一种重组ulp1融合蛋白酶，其特征在于，所述融合蛋白酶具有式i所示的结构：
2.如权利要求1所述的融合蛋白酶，其特征在于，所述融合蛋白酶特异性识别和切割sumo融合标签。
3.如权利要求1所述的融合蛋白酶，其特征在于，所述z1各自独立选自下组：
4.如权利要求1所述的融合蛋白酶，其特征在于，所述融合蛋白酶的氨基酸序列如seqid no:7所示。
5.如权利要求1所述的融合蛋白酶，其特征在于，所述融合蛋白酶的等电点pi≥4且≤6，较佳地<5.5，最佳地<5。
6.一种分离的多核苷酸，...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄宗庆，徐海悦，化浩举，路建光，张友，
申请(专利权)人：上海多米瑞生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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