【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于蛋白糖基检测，具体涉及一种特定蛋白多种糖基同步检测的方法及应用。
技术介绍
1、目前蛋白聚糖的一般分析方法主要有凝集素微阵列法及质谱法。凝集素微阵列是利用凝集素与聚糖表位的特异性亲和力而发展的糖组学分析方法。凝集素微阵列的最大优势为可在保持样品完整性的前提下，一次性获取多种糖基的信息，因此是最为常见的蛋白糖基化分析方法。然而，凝集素微阵列无法分析特定蛋白的糖基化。随着质谱检测技术及生物信息学的不断发展，质谱法已逐渐成为一种主流的糖基化分析技术。通常在进行质谱检测前，需利用酶切或其他化学手段将糖链从蛋白上释放，形成糖肽，并进行糖肽特异性富集。质谱法用于特定蛋白糖基分析时，需要首先提取并纯化特定蛋白，操作复杂，且难以保证蛋白结构的真实性。
2、近年来，一些研究开发了糖基化新型检测方法，进一步提高了蛋白糖基检测的灵敏度，并实现特定蛋白的糖基检测，如代谢糖标记法，利用修饰叠氮基团的非天然单糖与细胞孵育，经过细胞代谢后，将非天然单糖引入糖链中，再借助生物正交反应等方法对特定蛋白的糖链进行标记，如借助代谢糖标记法实现pd-l1蛋白糖基化的特异性检测。然而代谢糖标记法存在诸多限制，如仅能标记活细胞的糖基、仅有部分糖链形成可利用非天然单糖。guo等(guo,y.；tao,j.；li,y.；feng,y.；ju,h.；wang,z.；ding,l.,quantitativelocalized analysis reveals distinct exosomal protein-specificglycosignature
3、目前，已有多项研究利用凝集素对糖基进行识别，例如凝集素阵列、凝集素-blot等，该类方法主要是基于荧光分子标记或hrp标记，无法在同一样本中对多种糖基进行同步识别，需要对样本进行等分，尤其不利于微量样本的检测。中国专利技术专利cn 114717299 a公开了一种糖基化外泌体pd-l1的检测方法，该方法通过对凝集素标记单链dna，以适配体(一种单链dna)作为蛋白的亲和基团，基于适配体与凝集素的空间位置临近效应，借助酶及化学偶联在糖蛋白原位实现两条dna链的连接，并借助pcr等方法扩增并检测连接后的dna，但该方法仅能同时使用一种凝集素检测一种糖基化，无法实现多种凝集素的同步检测。同时，该方法只能使用适配体作为蛋白的亲和体，缺乏普适性。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术存在的缺点，提供一种特定蛋白多种糖基同步检测的方法，将蛋白亲和体的标签dna设计为具有多个糖基-dna置换模块的dna组装体，可实现对特定蛋白的多糖基同步检测，同时可针对不同的靶蛋白选择合适的亲和配体，具有更强的实用性。
2、本专利技术所述的特定蛋白多种糖基同步检测的方法，包括以下步骤：
3、(1)凝集素的dna标记：使用dna单链对凝集素进行标记，得到凝集素-dna；
4、(2)用于蛋白标记的dna组装体的设计及合成：dna组装体由一条骨架dna(dnabackbone)、封闭dna(locker dna)和对应凝集素-dna(lectin dna)的臂dna(arm dna)杂交而成；
5、(3)蛋白亲和体的dna标记：使用dna组装体对蛋白亲和体进行标记，得到蛋白亲和体-dna；
6、(4)多组装体复合物的构建：将蛋白亲和体-dna复合到金纳米上，得到gnp-dna复合体；
7、(5)向待测样品中先后加入gnp-dna复合体和凝集素-dna孵育，最后加入触发dna(trigger dna)，置换反应结束后离心提取上清液中的dna，通过pcr扩增臂dna并借助标准曲线相对定量，即为待测糖基的相对量；
8、(6)将待测蛋白标记dna标签，得到蛋白-dna，将蛋白-dna与置换反应结束后离心得到的沉淀共孵育，离心提取沉淀中的dna，通过pcr扩增对骨架dna与蛋白-dna进行相对定量，二者相对量的差值即为原始的蛋白量。进一步排除了由原始蛋白量不同引起的糖基定量差异。
9、优选的，所述凝集素优选与待测糖基特异性亲和的凝集素，包括刀豆素a(conconvalina，cona)、麦胚素(wheat germ agglutinin，wga)、花生凝集素(peanutagglutinin，pna)和大豆凝集素(soybean agglutinin，sba)。
10、优选的，凝集素的种类对应待测糖基的种类，每种凝集素均需dna标记，同理，臂dna的种类对应凝集素-dna的种类；在每条骨架dna上，封闭dna与臂dna等量。
11、优选的，蛋白亲和体为与待测蛋白有亲和作用的配体，包括抗体、纳米抗体、适配体或多肽。
12、优选的，分别对凝集素和蛋白亲和体进行标记的单链dna和dna组装体，以及触发dna，其设计原理是基于and逻辑门控的链置换反应。由于触发dna(trigger dna)与用于标记凝集素的凝集素dna分别比locker dna及arm dna多了5bp与dna backbone的碱基互补区域，因此可以引发链置换。但当trigger dna不存在时，locker dna与arm dna完全封闭了凝集素dna与dna backbone的所有互补位点，因此单独的凝集素dna无法触发链置换。
13、步骤(3)中，当蛋白亲和体为纳米抗体时，纳米抗体中可引入sortase a酶识别基序(lpetg)，首先将多肽ggggk与dna组装体连接，其中多肽的c端修饰羧基，dna组装体中的骨架dna的5’端修饰氨基，加入缩合剂nhs与edc(摩尔比nhs:edc:多肽：dna＝2：4：1：1)反应4h，将纯化后的产物多肽-dna与sortase a酶及纳米抗体在sortase buffer(5mm tris-hcl,0.15m nacl and 10mm cacl2,ph7.4)中共孵育2h。借助ni-nta树脂去除未反应的纳米抗体及sortase a酶，借助蛋白纯化柱去除多肽-dna复合物。由于每分子纳米抗体仅含有单个sortase a识别位点，因此可保证纳米抗体上标记单分子的dna组装体；
14、其他的蛋白类分子(包括凝集素、抗体、待测蛋白)，以及多肽、适配体与dna标签的结合主要依靠氨基修饰的dna标签与配体上的羧基反应，在缩合剂nhs及edc的催化作用下形成配体-dna的复合物。由于蛋白类分子可能包含多个羧基，因此在反应结束后需通过akta蛋白纯化仪，根据分子量分选出单个标记的蛋白-dna复合物本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种特定蛋白多种糖基同步检测的方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的特定蛋白多种糖基同步检测的方法，其特征在于：所述凝集素包括刀豆素A、麦胚素、花生凝集素和大豆凝集素。
3.根据权利要求1所述的特定蛋白多种糖基同步检测的方法，其特征在于：在每条骨架DNA上，封闭DNA与臂DNA等量。
4.根据权利要求1所述的特定蛋白多种糖基同步检测的方法，其特征在于：蛋白亲和体包括抗体、纳米抗体、适配体或多肽。
5.根据权利要求1所述的特定蛋白多种糖基同步检测的方法，其特征在于：所述触发DNA、标记凝集素的DNA单链、标记蛋白亲和体的DNA组装体，三者设计原理是基于AND逻辑门控的链置换反应。
6.如权利要求1-5任一项所述的特定蛋白多种糖基同步检测的方法在制备糖基检测试剂盒中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种特定蛋白多种糖基同步检测的方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的特定蛋白多种糖基同步检测的方法，其特征在于：所述凝集素包括刀豆素a、麦胚素、花生凝集素和大豆凝集素。
3.根据权利要求1所述的特定蛋白多种糖基同步检测的方法，其特征在于：在每条骨架dna上，封闭dna与臂dna等量。
4.根据权利要求1所述的特定蛋白多种...
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