【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及mirna检测，特别是涉及一种具有智能形态重构的核壳结构的dna纳米探针及其制备方法和应用。
技术介绍
1、mirna是一类内源性非编码rna，参与调节基因表达和多种细胞活动，其异常表达水平通常与包括癌症在内的多种疾病的发生有关。因此将mirna作为肿瘤诊断和预后评估的有价值的生物标志物，开发便捷的探针，用于体外灵敏及特异性检测mirna，特别是用于mirna的细胞内成像成为当今生物技术与医药领域研究者的关注热点。
2、然而，mirna尺寸小、丰度低以及同源性高等特征，使得mirna细胞内成像变得困难。为了解决这个问题，开发了不同的扩增策略用于开发灵敏的检测系统，例如聚合酶链式反应(pcr)、滚环扩增(rca)以及基于切口/聚合的链置换反应。此外，不同的无机材料也参与信号的放大过程，如量子点，金纳米颗粒和二氧化硅纳米颗粒等。但是繁琐的操作步骤、严格的反应温度要求以及无机材料的生物安全问题限制了它们的广泛适用性，甚至无法实现在活细胞内成像。
3、dna纳米材料因其优异的生物相容性，易修饰和功能化，高度可编程性满足了各种生物医学应用的需求，在细胞甚至活体成像和癌症靶向治疗等领域引起越来越多的关注。脱氧核酶是结合域和催化活性核心组成的一类基于dna的生物催化剂，可被设计用于金属离子或活性生物分子的检测，优异的分析性格能使脱氧核酶具有广泛的应用前景。然而，易被内源性核酸酶降解以及负电荷性质带来的低细胞摄取成为重要挑战。将脱氧核酶与转染试剂和无机纳米材料结合来解决这一问题通常使程序复杂化和潜在的生物毒
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本专利技术提供了一种具有智能形态重构的核壳结构的dna纳米探针及其制备方法和应用。本专利技术提供的dna纳米探针具有无细胞毒性、耐核酸酶降解和无需转染试剂即可实现检测的优势。
2、为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、本专利技术提供了一种具有核壳结构的dna纳米探针，所述dna纳米探针包括多个dna四面体和多个dna三链体；
4、所述dna四面体是由三条线性序列和一个环状序列通过部分序列碱基互补配对形成的四面体结构；所述三条线性序列为ta、tb和s-tc；所述ta的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述tb的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述s-tc的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述s-tc的第51位碱基t和第52位碱基t之间进行了二硫键修饰；所述环状序列由成环链和封口模板链制备得到；所述成环链的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述封口模板链的核苷酸序列如seq id no.5所示；
5、所述dna三链体是由序列s-bf、序列chol-l和序列e通过部分序列碱基互补配对形成的三链体结构；所述序列s-bf的核苷酸序列如seq id no.6所示，所述序列s-bf的第19位碱基t进行了猝灭基团修饰，第41位碱基a进行了rna修饰，3'端进行了荧光基团修饰；所述序列chol-l的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述序列chol-l的3'端进行了疏水基团修饰；所述序列e的核苷酸序列如seq id no.8所示；
6、每个dna四面体通过顶点处的回文碱基序列以碱基互补配对的方式连接形成外壳；所述dna三链体为内核；dna四面体的部分序列与dna三链体的部分序列以碱基互补配对方式连接。
7、优选的，所述疏水基团包括胆固醇。
8、优选的，所述荧光基团包括fam；所述猝灭基团包括bhq1。
9、优选的，所述dna四面体和dna三链体的摩尔比为1：1。
10、优选的，所述ta、tb、s-tc和环状序列的摩尔比为1：1：1：1；所述成环链和封口模板链的摩尔比为1：1。
11、优选的，所述序列s-bf、序列chol-l和序列e的摩尔比为1：1：1。
12、本专利技术提供了上述技术方案所述dna纳米探针的制备方法，包括以下步骤：
13、将所述成环链和封口模板链混合，依次进行加热变性、降温复性、dna连接酶连接和核酸外切酶酶切，得到所述环状序列；所述核酸外切酶包括核酸外切酶i和核酸外切酶iii；
14、将所述ta、tb、s-tc和所述环状序列混合，进行第一加热变性和降温复性，得到所述dna四面体；
15、将所述序列s-bf和序列chol-l混合，进行第二加热变性和降温复性，得到连接产物；
16、将所述连接产物和所述序列e混合，得到所述dna三链体；
17、将所述dna四面体和dna三链体混合，静置孵育，得到所述dna纳米探针。
18、优选的，所述第一加热变性和所述第二加热变性的温度均为90℃，时间均为5min。
19、本专利技术提供了上述技术方案所述dna纳米探针或利用上述技术方案所述制备方法制备得到的dna纳米探针在制备检测mirna-21试剂中的应用。
20、优选的，所述检测mirna-21试剂包括体内和/或体外成像试剂。
21、本专利技术提供了一种具有智能形态重构的dna纳米探针的构建方法，包括以下步骤：
22、提供具有发卡结构的脱氧核酶序列，并在末端连接能识别待检测mirna的序列；
23、构建dna四面体；所述dna四面体的三个顶点具有延伸的碱基序列，两个顶点延伸的碱基序列为回文碱基序列，第三个顶点延伸的碱基序列和所述脱氧核酶的部分序列互补配对；所述dna四面体的序列中含有二硫键修饰；
24、构建dna三链体；所述dna三链体是由底物链分别与所述脱氧核酶序列和胆固醇修饰的连接链通过部分序列碱基互补配对形成的三链体结构；所述底物链为发卡结构，并在互补配对位置分别修饰有荧光基团和猝灭基团，且具有脱氧核酶酶切位点；
25、将所述dna四面体和dna三链体在缓冲液中进行自组装，得到以dna四面体为外壳，dna三链体为中间层，胆固醇为内层的dna纳米探针。
26、有益效果：
27、本专利技术提供的dna纳米探针具有以下优点：
28、1、高效自组装核壳结构。本专利技术涉及的核壳结构dna纳米材料以dna四面体为外壳，dna三链体响应区为中间层，疏水性基团(胆固醇)为内层。其中每个dna四面体有两个顶点处具有回文碱基序列可增强dna四面体之间的聚集，且一个顶点末端延长的碱基序列用于与中间层的连接；内层胆固醇修饰的dna可作为两亲性分子(dna为亲水部分，胆固醇为疏水部分)，在水溶液中的固有性质可介导自组装的发生。
29、2、无细胞毒性。本专利技术涉及的dna纳米材料原材料均为dna，具有良好的生物相容性。
30、3、耐核酸酶降解。外层的dna四面体外壳可增强dna纳米材料的耐核酸酶降解。
31、4、形态重构自主性细胞内化，无需转染试剂。整个dna纳米材料外层为亲水部分，内层为疏水部分，外壳dna四面体轴向旋本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种具有核壳结构的DNA纳米探针，其特征在于，所述DNA纳米探针包括多个DNA四面体和多个DNA三链体；
2.根据权利要求1所述的DNA纳米探针，其特征在于，所述疏水基团包括胆固醇。
3.根据权利要求1或2所述的DNA纳米探针，其特征在于，所述荧光基团包括FAM；所述猝灭基团包括BHQ1。
4.根据权利要求1或2所述的DNA纳米探针，其特征在于，所述DNA四面体和DNA三链体的摩尔比为1：1。
5.根据权利要求1或2所述的DNA纳米探针，其特征在于，所述Ta、Tb、S-Tc和环状序列的摩尔比为1：1：1：1；所述成环链和封口模板链的摩尔比为1：1；所述序列S-BF、序列Chol-L和序列E的摩尔比为1：1：1。
6.权利要求1～5任一项所述DNA纳米探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述第一加热变性和所述第二加热变性的温度均为90℃，时间均为5min。
8.权利要求1～5任一项所述DNA纳米探针或利用权利要求6或7所述制备方法制备得到的D
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述检测miRNA-21试剂包括体内和/或体外成像试剂。
10.一种具有智能形态重构的DNA纳米探针的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种具有核壳结构的dna纳米探针，其特征在于，所述dna纳米探针包括多个dna四面体和多个dna三链体；
2.根据权利要求1所述的dna纳米探针，其特征在于，所述疏水基团包括胆固醇。
3.根据权利要求1或2所述的dna纳米探针，其特征在于，所述荧光基团包括fam；所述猝灭基团包括bhq1。
4.根据权利要求1或2所述的dna纳米探针，其特征在于，所述dna四面体和dna三链体的摩尔比为1：1。
5.根据权利要求1或2所述的dna纳米探针，其特征在于，所述ta、tb、s-tc和环状序列的摩尔比为1：1：1：1；所述成环链和封口模板链的摩尔比为1：1；所述序列s-bf、序...
【专利技术属性】
技术研发人员：申志发，潘文豪，陈林欢，吴再生，刘继成，杨远兵，
申请(专利权)人：上海志药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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