【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术和核酸药物领域，具体地，涉及一种优化的polya序列及其应用。
技术介绍
1、基于mrna的治疗方法，在实际应用中较为精准且可用于新型疫苗和个体化治疗，是现代医学发展的新方向。与哺乳动物细胞系中表达的重组蛋白相比，mrna的生产更快、更灵活。在过去十年中，mrna修饰和递送系统领域的技术发展迅速推进了mrna疫苗的基础和临床研究。然而，mrna疗法面临的技术问题也很明显，比如mrna 在体内表达效率低等问题，mrna疫苗的保护效力并不乐观，这些也是临床应用亟需优化的关键问题。
2、基于稳定性和蛋白翻译效率而优化开发的mrna，可以最大限度地提高mrna生产及避免递送中的损失问题。在mrna的结构特征中，有几个因素影响mrna疫苗的表达和稳定性，如cap、非翻译区(utr)、polya尾直接影响mrna稳定性和翻译效率。在mrna研究早期，科学家就发现其3’端尾部有多聚腺苷酸存在。事实上，除个别哺乳动物组蛋白的转录本外，真核生物几乎所有mrna都带有polya尾。polya尾是在转录的同时添加到mrna上的，是成熟mrna由细胞核外运至胞浆必需的。polya尾对翻译状态和mrna的稳定性都有贡献，因而是胞浆中基因表达的关键调节因子。特别是，polya尾可与mrna 5’端的7-甲基鸟嘌呤（m7g）在功能上起协同作用，促进翻译的进行。当一个转录本失去polya尾时，其翻译将处于较低水平，同时也意味着其5’端的帽子结构即将被去除，发生脱帽（decapping）。有研究人员在聚腺苷酸序列之间加入一个比较
3、polya尾巴的体外合成有2种策略：第一种是酶法加帽，利用重组polya聚合酶延长ivt反应合成的mrna。这种酶法加尾的方式无法产生固定长度的polya序列，不利于工艺生产过程中的质量控制。第二种是在质粒dna模板序列中加入一长段a序列或掺入其他核苷酸的polya尾巴，完成一步法共转录加尾。一步法加尾能够确保尾巴长度受到高度控制。而共转录加尾的挑战在于，质粒扩增过程可能导致尾巴丢失。因此，质粒模板及polya的完整性应作为发酵工艺开发的重要质量属性。
4、一个经典的rna结构包括5`端帽子结构、5`端非翻译区（untranslated region，utr）、编码区（coding regions，cds）、3`端utr、以及polya尾巴。其中3`端utr和polya尾巴对于mrna在胞内和各个组织器官中的稳定性具有决定性影响。其稳定性机制主要由内源mirna（microrna）、外源sirna（small interference rna）、外源aso（anti-sense oligonucleotides）介导的调控，以及由各种rna结合蛋白（rna binding proteins，rbp）组成更加复杂的调控网络。
5、在mrna成药领域，经纳米脂质体颗粒（lipid nano particle，lnp）或其他类型载体递送的大部分mrna被清除，只有少部分通过内体逃逸发挥药效，甚至逃逸后的mrna也可能会被先天免疫系统识别为外源核酸物质而加速清除。3`端的poly a尾巴可以保护帽结构不被降解，与poly a结合蛋白、5`cap（帽结构）和翻译起始因子蛋白协同作用，启动蛋白质的翻译。
6、因此，本领域亟待开发能够提高蛋白编码区翻译效率的polya序列，为制备高质量的mrna药物提供技术保障。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供能够提高蛋白编码区翻译效率的polya序列及其在制备mrna药物中的应用。
2、本专利技术的第一方面，提供了一种polya尾部元件，所述polya尾部元件用于构建mrna转录模板，提高所述mrna转录模板转录得到的mrna中编码区的翻译效率，其特征在于，所述polya元件的核苷酸序列如seq id no: 1所示，或与seq id no: 1所示的核苷酸序列具有≥70%的同源性。
3、在另一优选例中，所述polya尾部元件的核苷酸序列包括：与seq id no: 1所示的核苷酸序列具有≥70%（较佳地≥80%，更佳地≥90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%）的同源性，且具有提高mrna中编码区翻译效率活性的核苷酸序列；或
4、如seq id no: 1所示核苷酸序列的5`端和/或3`端增加和/或减少1-50个(较佳地1-30，更佳地1-10个，更佳地1-5个)核苷酸，且具有提高mrna中编码区翻译效率活性的核苷酸序列。
5、本专利技术的第二方面，提供了一种mrna转录模板构建体，所述构建体具有式i结构：
6、z1-z2-z3-z4-z5-z6-z7 (i)
7、式中，
8、z1、z7为无或酶切位点；
9、z2为无或启动子元件或内部核糖体进入位点序列（ires）；
10、z3为5`utr元件；
11、z4为可替换的编码区；
12、z5为3`utr元件；
13、z6为本专利技术第一方面所述polya尾部元件。
14、在另一优选例中，所述z1、z7为平末端酶切位点或粘性末端酶切位点。
15、在另一优选例中，所述z2为启动子元件，所述启动子选自下组：t7启动子、t3启动子、sp6启动子、cag启动子、ubc启动子、cmv启动子、u6启动子、ef1a启动子、pgk1启动子、tre启动子、ac5启动子、uas启动子、sv40启动子、adh1启动子、camv35s启动子、ubi启动子、lac启动子、ptac启动子、pl启动子，或其组合。
16、在另一优选例中，所述z4为用于预防和/或治疗传染性疾病、罕见遗传病、神经退行性疾病、视网膜病变、癌症或肿瘤的蛋白编码基因。
17、在另一优选例中，所述z4选自下组：病原体抗原基因、基因组中的转座子（包括沉默和活跃转座子）、细胞因子、生长因子、蛋白激素、多肽激素、肿瘤相关抗原（taa）、肿瘤特异性抗原（tsa）、通用肿瘤突变位点抗原、蛋白佐剂、多肽佐剂、核酸佐剂，或其组合。
18、本专利技术的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有如本专利技术第二方面所述的mrna转录模板构建体。
19、在另一优选例中，所述载体选自下组：dna、rna、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移系统，或其组合；优选地，所述载体为质粒。
20、本专利技术的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如本专利技术第三方面所述的载体。
21、在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种polyA尾部元件，所述polyA尾部元件用于构建mRNA转录模板，提高所述mRNA转录模板转录得到的mRNA中编码区的翻译效率，其特征在于，所述polyA尾部元件的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，或与SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列具有≥70%的同源性。
2. 一种mRNA转录模板构建体，其特征在于，所述构建体具有式I结构：
3.一种载体，所述载体含有如权利要求2所述的mRNA转录模板构建体。
4.一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如权利要求3所述的载体或如权利要求2所述的mRNA转录模板构建体。
5.一种产生用于制备mRNA药物的优化mRNA的方法，所述方法包括步骤：
6. 一种优化mRNA，所述优化mRNA是用如权利要求5所述的方法制备得到的，并且所述优化mRNA具有式II所示结构：
7. 一种药物组合物，所述药物组合物包含：
8.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物是将所述优化mRNA用阳离子脂进行包裹所形成的脂质纳米颗粒。
9.一种如
10.一种如权利要求6所述的优化mRNA或如权利要求7所述的药物组合物的用途，用于制备药物，所述药物用于预防和/或治疗传染性疾病、罕见遗传病、神经退行性疾病、视网膜病变、癌症或肿瘤。
...【技术特征摘要】
1.一种polya尾部元件，所述polya尾部元件用于构建mrna转录模板，提高所述mrna转录模板转录得到的mrna中编码区的翻译效率，其特征在于，所述polya尾部元件的核苷酸序列如seq id no: 1所示，或与seq id no: 1所示的核苷酸序列具有≥70%的同源性。
2. 一种mrna转录模板构建体，其特征在于，所述构建体具有式i结构：
3.一种载体，所述载体含有如权利要求2所述的mrna转录模板构建体。
4.一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如权利要求3所述的载体或如权利要求2所述的mrna转录模板构建体。
5.一种产生用于制备mrna药物的优化mrna的方法，所述方法包括步骤：
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【专利技术属性】
技术研发人员：王筱，李和，张园园，谷翰卿，徐增军，
申请(专利权)人：艾斯拓康医药科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：
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