【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体涉及一种快速筛选与诱饵rna结合的蛋白系统及方法和应用。
技术介绍
1、rna结合蛋白(rna-binding protein，rbp)通常被认为是通过一个或多个rna结合结构域(rbd)来结合rna并改变结合rna命运或功能的蛋白质。这些rbp广泛控制rna生命周期的每个阶段，包括mrna的合成和成熟，非编码rna(non-coding rna，ncrna)的激活、剪切、降解等，因此rna-蛋白质相互作用越来越被认为是病毒/病菌和宿主细胞间的rna-蛋白相互作用、转录组和蛋白质组调节的关键一环。因此，系统鉴定及定量rbps在细胞功能和疾病状态中的动态变化对于研究者了解复杂系统中的生理功能和疾病进展也具有重要意义，并对筛选有效的干扰多肽类药物具有重要的临床意义。
2、近年来，为了全面鉴定这些rna结合蛋白，并阐释rbp的动态组装行为，研究者发展了许多捕获rna结合蛋白的技术手段。较为常用的rna结合蛋白捕获方法可以主要分为靶向与无偏两种蛋白捕获方法，前者是已知想要研究的rna，通过一系列基于ap-ms或apex的方法将其相互作用蛋白下拉下来；而后者是基于核酸-蛋白复合体的固有特性将其富集出来。虽然已经发展出了一系列的研究技术，但任何一项技术都或多或少的存在不足因素。由此衍生的两个重要问题：第一，体外鉴定的rna-蛋白相互作用究竟多大程度反映了体内的情况？第二，有相互作用就意味着有功能吗？有鉴于这些问题，还有待进一步开发新的rna-蛋白相互作用的研究技术。此外，假阳性信号、样品用量较多、受到
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术提供一种快速筛选与诱饵rna结合的蛋白系统及方法和应用，可以在病毒基因治疗领域得到应用，还能用于研究生理功能和疾病进展，对药物研发提供有益信息，具有准确、快速、操作简单等优点，适用于基因功能研究及病毒核酸清除等领域。
2、本专利技术是通过以下技术方案实现的：
3、一种快速筛选与诱饵rna结合的蛋白系统，包括诱导表达自杀基因-诱饵载体和rna酶-待选rna结合蛋白融合表达载体；
4、所述诱导表达自杀基因-诱饵载体为可诱导表达的杂合rna，含有自杀基因表达框及诱饵rna；所述自杀基因为任意一个由基因编码的，可引起细胞毒性导致细胞死亡的基因；
5、所述rna酶-待选rna结合蛋白融合表达载体为sa-ncd-待选rna结合蛋白融合表达载体，其中rna酶为人源mcpip1的rna酶活性结构域ncd，通过基因工程手段将链霉亲和素sa与ncd构建到一起形成sa-ncd的重组蛋白，再将sa-ncd后面连接上待选rna结合蛋白编码序列，构建所述sa-ncd-待选rna结合蛋白融合表达载体；
6、当所述rna酶-待选rna结合蛋白融合表达载体中的待选rna结合蛋白特异识别诱饵rna时，融合表达载体中的rna酶活性会破坏诱导表达的杂合rna，使诱导表达的自杀基因减少，从而使细胞活下来，否则细胞死亡，通过检测活细胞融合表达载体的信息可知与诱饵rna结合的基因信息，从而获得rbp基因序列，实现快速筛选。
7、优选地，所述自杀基因为皂草素蛋白质序列，如seq id no.2所示；所述sa-ncd的重组蛋白的序列如seq id no.1所示。
8、优选地，所述待选rna结合蛋白为已确定的rna结合蛋白或基因表达文库。
9、一种基于上述的快速筛选与诱饵rna结合的蛋白系统的筛选方法，包括以下步骤：
10、步骤1)诱导表达自杀基因-诱饵载体的构建：
11、选择任意一个由基因编码的，可引起细胞毒性导致细胞死亡的基因作为自杀基因，构建诱导自杀基因-诱饵的母载体；运用rt-pcr或化学合成技术，合成编码待选的诱饵rna序列；通过常规的基因工程技术将诱饵rna序列导入所述诱导自杀基因-诱饵的母载体的多克隆位点，形成慢病毒表达载体，即为诱导表达自杀基因-诱饵载体；
12、步骤2)rna酶-待选rna结合蛋白融合表达载体的构建：
13、构建rna酶-待选rna结合蛋白融合表达载体的母载体；根据目的不同，运用表达文库构建或直接扩增/合成的待选rna结合蛋白编码序列的方法；通过常规的基因工程技术将待选rna结合蛋白编码序列导入所述rna酶-待选rna结合蛋白融合表达载体的母载体的多克隆位点，形成慢病毒表达载体，即为rna酶-待选rna结合蛋白融合表达载体；
14、步骤3)诱导自杀基因表达稳态表达细胞株建立，并筛选最低致死诱导试剂浓度：
15、通过步骤1)得到的诱导表达自杀基因-诱饵载体以慢病毒的形式感染真核细胞293，然后挑选单个细胞克隆，再扩大繁殖得到稳态表达细胞株；所述稳态表达细胞株通过加入不同浓度外源化合物诱导自杀基因表达，根据所使用的诱导试剂不同，需要进行系统浓度尝试，直到找到能杀死所有细胞的最低浓度，作为诱导试剂浓度；
16、步骤4)利用步骤2)得到的rna酶-待选rna结合蛋白融合表达载体感染步骤3)得到的稳态表达细胞株，加入诱导试剂杀死不能靶向切割自杀基因的细胞，存活下来的细胞含有vrbd序列：
17、通过步骤2)得到的rna酶-待选rna结合蛋白融合表达载体以慢病毒的形式感染步骤3)得到的稳态表达细胞株；再用步骤3)得出的诱导试剂浓度进行筛选，直到细胞在筛选压力下，依然可存活，则所获得的细胞可能含有与靶标rna细胞的蛋白；
18、步骤5)通过回收dna及测序获得vrbp基因序列，完成筛选：
19、提取步骤4)所获得细胞的基因组dna，然后以步骤2)得到的rna酶-待选rna结合蛋白融合表达载体上多克隆位点两侧序列设计引物；再以步骤4)所获得细胞的基因组dna为模板，通过引物进行pcr扩增，然后通过高通量测序方法进行测序，分析序列信息即可知可能与靶标rna结合的蛋白信息，完成筛选。
20、优选地，步骤1)所述诱导自杀基因-诱饵的母载体为pcdh-sa-ncd-mcs，构建方法如下：
21、以sa-ncd序列为模板，通过引物sa-ncd-f和sa-ncd-r进行pcr扩增，pcr产物纯化后，利用限制性内切酶xbai和ecor1处理纯化产物；同时取pcdh载体，同样用xbai和ecor1酶切，然后进行凝胶电泳，将大片段切下并回收产物；将酶切产物采用t4 dna连接酶进行连接；将连接产物加入到感受态细胞中进行连接，并涂于lb固体平板；经过对单克隆进行酶切及测序鉴定，即得；
22、其中，sa-ncd编码序列如seq id no.3所示；引物sa-ncd-f序列如seq id no.4所示；引物sa-ncd-r序列如seq id no.5所示。
23、优选地，步骤2)所述rna酶-待选rna结合蛋白融合表达载体的母载体为plvx-tetone-mcherry-2a-sap2-mcs-pu本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种快速筛选与诱饵RNA结合的蛋白系统，其特征在于，包括诱导表达自杀基因-诱饵载体和RNA酶-待选RNA结合蛋白融合表达载体；
2.根据权利要求1所述的一种快速筛选与诱饵RNA结合的蛋白系统，其特征在于，所述自杀基因为皂草素蛋白质序列，如SEQ ID NO.2所示；所述SA-NCD的重组蛋白的序列如SEQID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的一种快速筛选与诱饵RNA结合的蛋白系统，其特征在于，所述待选RNA结合蛋白为已确定的RNA结合蛋白或基因表达文库。
4.一种基于权利要求1-3任一项所述的快速筛选与诱饵RNA结合的蛋白系统的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，步骤1)所述诱导自杀基因-诱饵的母载体为PCDH-SA-NCD-MCS，构建方法如下：
6.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，步骤2)所述RNA酶-待选RNA结合蛋白融合表达载体的母载体为pLVX-TetOne-mCherry-2A-SAP2-MCS-Puro，构建方法如下：
7.根
8.如权利要求1-3任一项所述的快速筛选与诱饵RNA结合的蛋白系统在制备靶向RNA的药物中的应用。
9.如权利要求5所述的筛选方法在制备靶向RNA的药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种快速筛选与诱饵rna结合的蛋白系统，其特征在于，包括诱导表达自杀基因-诱饵载体和rna酶-待选rna结合蛋白融合表达载体；
2.根据权利要求1所述的一种快速筛选与诱饵rna结合的蛋白系统，其特征在于，所述自杀基因为皂草素蛋白质序列，如seq id no.2所示；所述sa-ncd的重组蛋白的序列如seqid no.1所示。
3.根据权利要求1所述的一种快速筛选与诱饵rna结合的蛋白系统，其特征在于，所述待选rna结合蛋白为已确定的rna结合蛋白或基因表达文库。
4.一种基于权利要求1-3任一项所述的快速筛选与诱饵rna结合的蛋白系统的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
5....
【专利技术属性】
技术研发人员：刘清华，吴晓月，李燕强，宋昱，郭羽白，李海英，
申请(专利权)人：徐州医科大学，
类型：发明
国别省市：
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