一种厌氧氨氧化菌的分离方法技术

本发明专利技术公开了一种厌氧氨氧化菌的分离方法，该方法包括：采集原料：采集颗粒污泥为原料，将所述颗粒污泥制成菌悬液；初筛富集培养：对制成的所述菌悬液进行初筛富集培养得到初筛培养物；复筛鉴定培养：对所述初筛富集培养得到的培养物进行复筛鉴定培养，对复筛鉴定培养后得到的培养物进行检测，若检测合格则培养物的菌株即为厌氧氨氧化菌。该分离方法不但具有简单、快速分离厌氧氨氧化菌的优点，且可以获得厌氧氨氧化菌的纯培养物，为微生物学理论研究和工业化应用提供帮助。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种具有厌氧氨氧化活性菌的分离方法。
技术介绍
厌氧氨氧化(Anaerobic ammonia oxidation, ΑΝΑΜΜ0Χ)技术由于具有高效、低耗 和环境友好等特性已在废水处理方面受到研究者们的广泛关注。与传统硝化_反硝化生物 脱氮方法相比，厌氧氨氧化工艺具有以下优点厌氧氨氧化菌为自养菌，无需外加有机物作 为电子供体，既可节省费用，又可以防止二次污染在厌氧氨氧化反应中，只需要将氨厌氧 氨氧化成亚硝酸盐，相比较传统硝化_反硝化过程中需要投加酸碱药剂，而厌氧氨氧化反 应为近中性反应，生物产酸量很低，因此可以节省中和药剂费用；由于厌氧氨氧化菌生长缓 慢，所以污泥产量极少，可以大大节约污泥处理处置费用。厌氧氨氧化技术能有效克服传统 生物脱氮工艺的缺点，因此在废水生物脱氮领域具有良好的开发前景。厌氧氨氧化这种生物脱氮技术的研究历程虽已有十余年的历史，但至今仍未广泛 应用于工程实践。目前已经分离到的厌氧氨氧化菌均是采用密度梯度离心法得到的。密度 梯度离心法是纯化病毒常用的方法，并不是菌株常用的分离方法。使用密度梯度离心法分 离菌株，对实验室的等级要求较高，不宜普及。本专利技术涉及一种典型的微生物分离方法，比 现有的密度梯度离心法分离厌氧氨氧化菌简单、快速。
技术实现思路
为了解决上述现有技术存在的不足之处，本专利技术的目的在于利用一种典型的微生 物分离方法，比现有的密度梯度离心法分离厌氧氨氧化菌相比具有简单、快速的特点。为了达到上述目的，本专利技术通过以下方案来实现本专利技术实施例提供，包括采集原料采集颗粒污泥为原料，将所述颗粒污泥制成菌悬液；初筛富集培养对制成的所述菌悬液进行初筛富集培养得到初筛培养物；复筛鉴定培养对所述初筛富集培养得到的初筛培养物进行复筛鉴定培养，对复 筛鉴定培养后得到的培养物进行检测，若检测合格则培养物的菌株即为厌氧氨氧化菌。通过本专利技术实施例提供的技术方案可以看出，本专利技术实施例中以采集的颗粒污泥 为原料，制成菌悬液后，依次经初筛富集培养和复筛鉴定培养后，即可分离得到厌氧氨氧化 菌。该方法步骤简单，可实现从颗粒污泥快速分离厌氧氨氧化菌，具有简单、快速的优点。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术作进一步具体的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例1本实施例提供，相比现有通过密度梯度离心法分离 厌氧氨氧化菌具有简单、快速的优点，该方法具体如下采集原料采集颗粒污泥为原料，将所述颗粒污泥制成菌悬液；可采用取自上流 式厌氧污泥床中的颗粒污泥溶液为原料，用超声波将颗粒污泥溶液中的颗粒污泥破碎后， 制成菌悬液。初筛富集培养对制成的所述菌悬液进行初筛富集培养得到初筛培养物；具体是 将所述菌悬液转入初筛厌氧氨氧化富集培养基中，采用焦性没食子酸法，该焦性没食子酸 法具体是在干燥无菌的玻璃板或培养皿盖上，铺设一层灭菌脱脂棉或纱布，将焦性没食子 酸设置在所述脱脂棉或纱布上；向所述焦性没食子酸上滴加氢氧化钠溶液后，将所述玻璃 板或培养皿盖覆盖于装有已接种所述菌悬液的初筛厌氧氨氧化富集培养基的培养皿的皿 底上，使设有焦性没食子酸和氢氧化钠溶液的所述脱脂棉或纱布全部罩住培养皿的皿口， 以溶化的石蜡或凡士林液密封培养皿的皿底与玻璃或皿盖的接触处，使所述菌悬液在密闭 的由焦性没食子酸与氢氧化钠溶液反应形成的厌氧环境下在初筛厌氧氨氧化富集培养基 中进行培养。在25 35°C温度下厌氧培养10 15天，培养后得到初筛培养物。上述初筛富集培养中，所用的初筛厌氧氨氧化富集培养基由下述各原料按重量 份组成蒸馏水1000000份、碳酸氢钾400 600份、磷酸氢二钠25 30份、七水硫酸镁 200 400份、氯化钙120 140份、亚硝酸钠130 150份、硫酸铵130 150份、微量元 素I 0. 5 2份、微量元素II 0. 5 2份和酵母膏或葡萄糖贮备液0. 5 2份。上述初筛厌氧氨氧化富集培养基中的微量元素I由下述各原料按重量份组成蒸 馏水1000000份、乙二胺四乙酸4000 6000份和硫酸亚铁4000 6000份。上述初筛厌氧氨氧化富集培养基中的微量元素II由下述各原料按重量份组成 蒸馏水1000000份、乙二胺四乙酸14000 16000份、七水硫酸锌200 400份、六水氯化 钴200 300份、四水氯化锰900 1050份、五水硫酸铜200 300份、二水钼酸钠200 250份、六水氯化镍180 200份、十水硒酸钠200 220份和硼酸13 15份。上述初筛厌氧氨氧化富集培养基中的酵母膏或葡萄糖贮备液由下述各原料按重 量份组成蒸馏水1000000份、酵母膏或葡萄糖100 250份。复筛鉴定培养对所述初筛富集培养得到的初筛培养物进行复筛鉴定培养，对复 筛鉴定培养后得到的培养物进行检测，若检测合格则培养物的菌株即为厌氧氨氧化菌。上述复筛鉴定培养具体过程为将初筛富集培养后得到的初筛培养物接入复筛鉴定培养基中，采用厌氧滚管培养 法，在30 40°C温度下厌氧培养3 5天，得到复筛培养物；检测复筛培养物中菌株在厌氧条件下同时转化氨和亚硝酸盐的能力，若达到相应 标准，则确认复筛培养物中的菌株即为厌氧氨氧化菌。上述复筛鉴定培养中所用的复筛鉴定培养基由下述原料按重量份组成蒸馏水 1000份、硫酸铵1 3份、亚硝酸钠1 3份、牛肉膏2 5份、蛋白胨5 20份和氯化钠 3 10份；该复筛鉴定培养基的pH值为6. 7 8. 3。上述复筛鉴定培养中采用的厌氧滚管培养法具体为将装有融化的复筛鉴定培养基的试管放置于40 60°C的恒温水浴中，用无菌注 射器吸取初筛培养物于所述试管内融化的复筛鉴定培养基中，而后将试管平放于装有冰块 的盘中或滚管机上进行滚动，使带菌的融化的复筛鉴定培养基在试管内壁凝固形成薄层， 处理后将试管置于30 40°C的恒温培养箱中进行培养。本专利技术实施例中通过，在初筛富集培养中，采用焦性没食子酸法，通过焦性没食子 酸和氢氧化钠溶液反应，可提高良好的厌氧环境，使装有已接种菌悬液的初筛初筛厌氧氨 氧化富集培养基在密封的厌氧化环境中进行培养；而微量元素I和微量元素II的可提供厌 氧氨氧化菌必需的微量元素，利于厌氧氨氧化菌的生长，并且能抑制其他厌氧菌的生长。酵 母膏或葡萄糖贮备液提供厌氧氨氧化菌生长所必需的碳源。该方法操作简单，成本低，对厌 氧氨氧化菌分离效果好。实施例2本实施例提供，相比现有通过密度梯度离心法分离 厌氧氨氧化菌具有简单、快速的优点，该方法具体如下步骤1，采集颗粒污泥为原料选取上流式厌氧污泥床(UASB)中的颗粒污泥溶液 作为分离源；步骤2，对采集的颗粒污泥原料进行处理，用超声波破碎颗粒污泥溶液，制成菌悬 液；步骤3，初筛富集培养将步骤2中制成的菌悬液转入初筛厌氧氨氧化富集培养 基，可用涂布方式涂布在初筛厌氧氨氧化富集培养基上，酵母膏或葡萄糖贮备液0. 5mg/L 中，采用焦性没食子酸法，在25 35°C温度下厌氧培养10 15天，培养后得到初筛培养 物；上述步骤3中的初筛厌氧氨氧化富集培养基由下述原料组成蒸馏水，其它各 原料按每升蒸馏水的量进行加入，包括KHCO3(碳酸氢钾)400mg/L、KH2PO4(磷酸氢二 钠)25mg/L、MgSO4 · 7H20 (七水硫酸镁)200mg/L、CaC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种厌氧氨氧化菌的分离方法，其特征在于，包括：　　采集原料：采集颗粒污泥为原料，将所述颗粒污泥制成菌悬液；　　初筛富集培养：对制成的所述菌悬液进行初筛富集培养得到初筛培养物；　　复筛鉴定培养：对所述初筛富集培养得到的初筛培养物进行复筛鉴定培养，对复筛鉴定培养后得到的培养物进行检测，若检测合格则培养物的菌株即为厌氧氨氧化菌。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：屈佳玉，
申请(专利权)人：北京桑德环保集团有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]