【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种抑制肿瘤生长及肺转移的人工外泌体及其应用。
技术介绍
1、肿瘤是威胁人类健康的重要因素，常规的抗肿瘤药物大多只能针对原位肿瘤，对转移性肿瘤的效果有限，因此有必要开发能有效抑制肿瘤转移的药物。研究发现除了癌细胞的固有特性外，肺部微环境与癌细胞之间的相互作用也参与了肺部病变的形成和发展。癌细胞可以扰乱肺脏重塑过程，启动一个恶性循环，支持肺部播散性肿瘤细胞的发展。值得注意的是，肺部微环境也会对肿瘤细胞进行重编程，赋予它们不同于原发癌症的特征，从而促进继发性转移。这些突破有助于阐明癌症肺转移级联反应并改变患者的治疗方法。
2、外泌体是一种由真核细胞分泌的50-150 nm 粒径的细胞外囊泡。对于骨肉瘤，外泌体是早期诊断和预测预后的有希望的生物标志物。此外，在肿瘤发展过程中，外泌体通过转移生物活性货物（包括脂质、蛋白质和调节rna）来调节细胞生长、转移和血管生成。骨间充质干细胞来源的外泌体mirna-769-5p通过靶向双特异性磷酸酶16 (dusp16)促进骨肉瘤转移。此外，降低骨肉瘤中的mirna-135a也可以抑制骨肉瘤进展和肺转移。然而，有研究报道单个mirna作用具有不确定性和矛盾性，使其无法用作有效的治疗靶点。一组位于染色体上相邻的mirna基因产生mirna簇；组织成簇的mirna可以共享相同的转录调节方式，因此它们可能是更可靠的生物标志物和药物靶标。
3、外泌体作为细胞间通讯， 参与生理和病理过程的货物分子从亲本细胞转移到受体细胞。这种细胞间运输可以针对邻近细
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种抑制肿瘤肺转移mirna簇表达的人工外泌体在转移性肿瘤中的治疗及药物中的应用。
2、本专利技术的另一目的是提供所述人工外泌体的制备方法，该方法简单，易于操作，成本低。
3、本专利技术还提供所述外泌体的应用。
4、本专利技术的目的采用如下技术方案实现：
5、一种用于治疗转移性肿瘤的人工外泌体，所述的人工外泌体为外泌体膜包裹的mirna-194-5p/mirna-215-5p簇拮抗剂纳米颗粒所得；所述的mirna-194-5p /mirna-215-5p簇拮抗剂纳米颗粒为含有针对mirna-194-5p的拮抗剂和针对mirna-215-5p的拮抗剂的纳米颗粒；mirna-194-5p序列如seq id no.1所示，mirna-215-5p序列如seq id no.2所示。
6、作为本专利技术的一种优选，所述的mirna-194-5p/mirna-215-5p簇拮抗剂纳米颗粒由阳离子牛血清白蛋白（cbsa）偶联针对mirna-194-5p的拮抗剂和针对mirna-215-5p的拮抗剂所得。
7、作为本专利技术的一种优选，针对mirna-194-5p的拮抗剂为对5’-uccacauggaguugcuguuaca-3’序列全链进行甲基化修饰，且在5’端的2个碱基进行硫代修饰，在3’端的4个碱基进行硫代修饰所得的核酸；针对mirna-215-5p的拮抗剂为对5’-gucugucaauucauaggucau-3’序列全链进行甲基化修饰，且在5’端的2个碱基进行硫代修饰，在3’端的4个碱基进行硫代修饰所得的核酸。
8、作为本专利技术的一种优选，cbsa与mirna-194-5p和mirna-215-5p的质量比为45~25:1。
9、作为本专利技术的一种优选，所述的mirna-194-5p和mirna-215-5p簇纳米颗粒通过以下方法制备得到：将anta-mirna-194-5p和anta-mirna-215-5p用无rna酶的水溶解后，按照比例与cbsa溶液混合，然后在0~4℃下孵育20~40分钟。
10、一种制备本专利技术所述的人工外泌体的制备方法，包括以下步骤：
11、a) 制备外泌体膜；
12、b) 制备mirna-194-5p/mirna-215-5p簇拮抗剂纳米颗粒；
13、c) 利用外泌体膜包被mirna-194-5p/mirna-215-5p簇拮抗剂纳米颗粒，形成所述人工外泌体。
14、作为本专利技术的一种优选，mirna-194-5p/mirna-215-5p簇拮抗剂纳米颗粒的制备方法为：将针对mir-194-5p和mir-215-5p的拮抗剂用无rna酶的水溶解后，与cbsa溶液混合，然后在0~4℃下孵育20~40分钟。
15、作为本专利技术的一种优选，cbsa与针对mirna-194-5p和mirna-215-5p的拮抗剂的质量比为45~25:1；针对mirna-194-5p的拮抗剂为对5’-uccacauggaguugcuguuaca-3’序列全链进行甲基化修饰，且在5’端的2个碱基进行硫代修饰，在3’端的4个碱基进行硫代修饰所得的核酸；针对mirna-215-5p的拮抗剂为对5’-gucugucaauucauaggucau-3’序列全链进行甲基化修饰，且在5’端的2个碱基进行硫代修饰，在3’端的4个碱基进行硫代修饰所得的核酸。
16、本专利技术还提供所述所述的人工外泌体的制备方法，包括如下步骤：
17、1、肿瘤细胞外泌体的分离:
18、a. 培养肿瘤细胞（例如hos-lut3）48小时。
19、b. 收集培养上清，并使用差速离心法分离外泌体。
20、c. 首次离心（2000 g，10分钟），收集上清。
21、d. 第二次离心（10000 g，30分钟），再次收集上清。
22、e. 第三次离心（110000 g，70分钟），收集沉淀，并用pbs重悬。
23、f. 第四次离心（110000 g，70分钟），收集并重悬外泌体于适量pbs中。
24、2、外泌体膜的制备:
25、a. 将收集的外泌体重悬于冰冷的tris-mgcl2缓冲液中。
26、b. 在-80℃下快速冷冻，然后在室温下解冻。
27、c. 重复冻融循环五次以上。
28、d. 将混合物与1m蔗糖混合至终浓度0.25m，后2000 g离心10分钟。
29、e. 收集上清，加入rna酶，进一步3000 g离心30分钟，收集外泌体膜。
30、f. 用0.25m蔗糖的低温tm缓冲液洗涤外泌体膜，再3000 g离心30分钟。
31、3、mirna-194-5p/mirna-215-5p簇拮抗剂纳米颗粒的制备:
32、a. 用无rna酶水将anta-mirna-194-5p和anta-mirna-215-5p按照质量比1:1溶解。
33、b. 按照比例（anta-mirna/cbsa = 1/30，w/w）将anta-mirna-194-本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种人工外泌体，其特征在于，所述的人工外泌体为外泌体膜包裹的miRNA-194-5p/miRNA-215-5p簇拮抗剂纳米颗粒所得；所述的miRNA-194-5p /miRNA-215-5p簇拮抗剂纳米颗粒为含有针对miRNA-194-5p的拮抗剂和针对miRNA-215-5p的拮抗剂的纳米颗粒；miRNA-194-5p序列如SEQ ID NO.1所示，miRNA-215-5p序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的人工外泌体，其特征在于所述的miRNA-194-5p/miRNA-215-5p簇拮抗剂纳米颗粒由阳离子血清白蛋白偶联针对miRNA-194-5p的拮抗剂和针对miRNA-215-5p的拮抗剂所得。
3.根据权利要求2所述的人工外泌体，其特征在于针对miRNA-194-5p的拮抗剂为对5’-UCCACAUGGAGUUGCUGUUACA-3’序列全链进行甲基化修饰，且在5’端的2个碱基进行硫代修饰，在3’端的4个碱基进行硫代修饰所得的核酸；针对miRNA-215-5p的拮抗剂为对5’-GUCUGUCAAUUCAUAGGUCA
4.根据权利要求3所述的人工外泌体，其特征在于阳离子牛血清白蛋白与针对miRNA-194-5p和miRNA-215-5p的拮抗剂的质量比为45~25:1。
5.根据权利要求4所述的人工外泌体，其特征在于所述的miRNA-194-5p和miRNA-215-5p簇纳米颗粒通过以下方法制备得到：将针对miRNA-194-5p和miRNA-215-5p的拮抗剂用无RNA酶的水溶解后，按照比例与阳离子牛血清白蛋白溶液混合，然后在0~4℃下孵育20~40分钟。
6.一种制备权利要求1-5中任一项所述的人工外泌体的制备方法，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于miRNA-194-5p/miRNA-215-5p簇拮抗剂纳米颗粒的制备方法为：将针对miRNA-194-5p和miRNA-215-5p的拮抗剂用无RNA酶的水溶解后，与阳离子血清白蛋白溶液混合，然后在0~4℃下孵育20~40分钟。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于阳离子牛血清白蛋白与针对miRNA-194-5p和miRNA-215-5p的拮抗剂的质量比为45~25:1；针对miRNA-194-5p的拮抗剂为对5’-UCCACAUGGAGUUGCUGUUACA-3’序列全链进行甲基化修饰，且在5’端的2个碱基进行硫代修饰，在3’端的4个碱基进行硫代修饰所得的核酸；针对miRNA-215-5p的拮抗剂为对5’-GUCUGUCAAUUCAUAGGUCAU-3’序列全链进行甲基化修饰，且在5’端的2个碱基进行硫代修饰，在3’端的4个碱基进行硫代修饰所得的核酸。
9.权利要求1所述的人工外泌体在制备治疗肿瘤和/或肿瘤转移的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述的肿瘤为骨肉瘤、乳腺癌或黑色素瘤；所述的肿瘤转移为肿瘤的肺转移。
...【技术特征摘要】
1.一种人工外泌体，其特征在于，所述的人工外泌体为外泌体膜包裹的mirna-194-5p/mirna-215-5p簇拮抗剂纳米颗粒所得；所述的mirna-194-5p /mirna-215-5p簇拮抗剂纳米颗粒为含有针对mirna-194-5p的拮抗剂和针对mirna-215-5p的拮抗剂的纳米颗粒；mirna-194-5p序列如seq id no.1所示，mirna-215-5p序列如seq id no.2所示。
2.根据权利要求1所述的人工外泌体，其特征在于所述的mirna-194-5p/mirna-215-5p簇拮抗剂纳米颗粒由阳离子血清白蛋白偶联针对mirna-194-5p的拮抗剂和针对mirna-215-5p的拮抗剂所得。
3.根据权利要求2所述的人工外泌体，其特征在于针对mirna-194-5p的拮抗剂为对5’-uccacauggaguugcuguuaca-3’序列全链进行甲基化修饰，且在5’端的2个碱基进行硫代修饰，在3’端的4个碱基进行硫代修饰所得的核酸；针对mirna-215-5p的拮抗剂为对5’-gucugucaauucauaggucau-3’序列全链进行甲基化修饰，且在5’端的2个碱基进行硫代修饰，在3’端的4个碱基进行硫代修饰所得的核酸。
4.根据权利要求3所述的人工外泌体，其特征在于阳离子牛血清白蛋白与针对mirna-194-5p和mirna-215-5p的拮抗剂的质量比为45~25:1。
5.根据权利要求4所述的人工外泌体，其特征在于所述的mirna-194-5p和m...
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