【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及糖生化分析领域，具体涉及α-氰基-3-氨基肉桂酸反应型基质在maldi质谱中对还原糖检测分析的应用
技术介绍
1、糖基化是蛋白质最关键和最多样的翻译后修饰之一，在许多生物学过程中发挥着重要作用，如蛋白质折叠、细胞免疫反应、细胞间信号传导和蛋白质翻译调控。越来越多的研究表明，异常的糖基化与多种疾病有关，如肿瘤、感染等。因此，聚糖的表征对糖生物学研究具有重要意义。
2、基质辅助激光解吸/电离质谱法(maldi-ms)具有软电离、高耐盐性、低样品消耗和易于制备样品的优点，已广泛应用于各种高度异质性生物分子的检测，如蛋白质、核酸和碳水化合物。然而，由于糖类化合物的天然丰度低和电离效率差，maldi-ms检测聚糖仍然受到挑战。2，5-二羟基苯甲酸(dhb)是检测聚糖最常用的maldi基质，但它容易与分析物在靶板上形成不均匀的针状结晶，重现性差，检测灵敏度也有限，极大地限制了它对聚糖的定性定量分析。
3、为了提高聚糖的电离效率，化学衍生是一种常用的方法，通过在糖链上引入一些容易电离的基团可以明显提高聚糖的离子化效率。然而，传统的化学衍生化方法，如全甲基化和还原胺化，往往会引入过量的杂质，需要经过复杂的后处理才能达到检测的要求，而且在繁琐的纯化过程中也容易导致样品的损失。与还原胺化相比，非还原胺化由于无需添加还原剂，操作简便，成为近年来人们研究和应用得比较多的一种化学衍生化方法。为了尽可能地实现聚糖的完全衍生化，添加的衍生化试剂通常都需要大大过量，这也给后续的纯化处理过程增加了难度，即使是非还原胺化也难以
4、目前已经报道的聚糖的反应型基质都是基于非还原胺化的原理，如3-氨基喹啉(3-aq)、2,5-二羟基苯甲酰肼(dhbh)、2-肼基对苯二甲酸(2-hta)等。3-aq本就是检测聚糖的传统基质，dhbh和2-hta则是在传统基质dhb的骨架结构上进行功能性改造，引入容易与聚糖还原端反应的活性基团。α-氰基-4-羟基肉桂酸(chca)也是一种常用的maldi基质，主要用于多肽和蛋白质的检测，其在maldi激光波长(355nm)处有远高于dhb的能量吸收，因此，设计和开发基于chca骨架结构的新型maldi反应型基质对实现还原糖的高通量定性定量检测具有深远的意义。
技术实现思路
1、本专利技术提供了α-氰基-3-氨基肉桂酸作为maldi反应型基质在还原糖分析中的应用，3-caca(α-氰基-3-氨基肉桂酸)作为反应型基质与chca(α-氰基-4-羟基肉桂酸)进行组合(chca/3-caca)在还原糖分析中的应用。在maldi质谱中，基于chca/3-caca的靶板衍生化策略可实现对还原糖的高通量定性定量分析。3-caca具有氨基反应基团，作为反应型基质可以与还原性n-聚糖的半缩醛进行脱水反应生成席夫碱，从而提高还原糖的电离化效率；同时，3-caca作为基质可辅助糖类化合物的离子化，因此过量的3-caca无需分离。chca为有机酸，可极大地催化衍生化反应的进行；同时chca作为传统有机基质在maldi激光波长(355nm)处有极高的能量吸收，可以促进糖类化合物的解吸电离。此外，结构相似却具备不同酸碱度的chca与3-caca的组合使用可显著改善样品结晶的均匀度，提高定量检测的准确性。本专利技术所述的3-caca结构式如式(1)所示：
2、
3、所述的3-caca(α-氰基-3-氨基肉桂酸)和chca(α-氰基-4-羟基肉桂酸)的组合型基质在maldi质谱中对还原糖检测的应用。3-caca为反应型基质，具有氨基反应基团，可与糖链的还原末端的半缩醛反应。chca为催化剂，可显著促进3-caca与还原糖的衍生化反应。
4、所述的对还原糖检测为对还原糖进行高通量定性定量检测，所述的应用具体包括如下步骤：
5、1、试剂配制
6、以二甲亚砜与甲醇的等体积混合溶剂配制chca溶液，chca为α-氰基-4-羟基肉桂酸；以3-caca为溶质，3-caca为α-氰基-3-氨基肉桂酸，chca溶液为溶剂，配制chca/3-caca混合基质溶液；配制还原糖的水溶液；
7、2、点样
8、分别取等体积的还原糖的水溶液和chca/3-caca混合基质溶液，依次点在maldi靶板的同一个点样孔，在靶板上直接混合均匀，得到点样后的靶板。
9、3、靶板衍生化反应
10、点样后的靶板在55～70℃下放置25～40min，混合样品点完全干燥，进行maldi质谱分析。
11、步骤1中，用于溶解基质的二甲亚砜和甲醇为分析纯或色谱级溶剂；
12、配制还原糖的水溶液的溶剂是超纯水或双蒸水；
13、所述的chca/3-caca混合基质溶液中3-caca的浓度为0.01～0.05mol/l，进一步优选为0.03mol/l；
14、所述的chca/3-caca混合基质溶液中chca的浓度为0.05～0.15mol/l，进一步优选为0.10mol/l；
15、步骤2中，还原糖的水溶液的点样体积为0.5～1.0μl；
16、chca/3-caca混合基质溶液的点样体积为0.5～1.0μl；
17、还原糖的水溶液和chca/3-caca混合基质溶液的混匀使用移液枪在抛光靶板进行重复吸打10～20次；
18、步骤3中，点样后的靶板在60℃下放置30min，
19、所述的maldi质谱分析采用的检测模式为正离子反射模式。
20、本专利技术中所述的“maldi质谱”是指基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tof-ms)，简称为maldi质谱。maldi的工作原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶，基质从激光中吸收能量传递给样品分子而使其电离的过程。maldi是一种软电离技术，适用于生物大分子的测定。
21、本专利技术中所述的“反应型基质”是指作为常规基质辅助还原糖电离的同时，可与其还原端半缩醛发生快速反应，共价结合离子化标签，提高电离化效率。
22、本专利技术中所述的“靶板衍生化策略”是指在靶板上样品的点样和衍生同步进行，极大地简化了操作步骤，兼容了maldi的高通量特性。
23、本专利技术中所述的衍生化效率＝衍生化产物峰强度/(衍生化产物峰强度+未衍生的峰强度)
24、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
25、1、3-caca与传统有机酸基质chca具有类似的骨架结构，对maldi激光能量可进行有效吸收和传递，适用于作为糖类物质的基质。
26、2、chca/3-caca本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.α-氰基-3-氨基肉桂酸作为MALDI反应型基质在还原糖分析中的应用。
2.α-氰基-3-氨基肉桂酸作为MALDI反应型基质与α-氰基-4-羟基肉桂酸进行组合在还原糖分析中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的α-氰基-3-氨基肉桂酸如式(1)所示：
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的在还原糖分析中的应用为对还原糖进行高通量定性定量检测，具体包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤1中，所述的CHCA/3-CACA混合基质溶液中3-CACA的浓度为0.01～0.05mol/L。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤1中，所述的CHCA/3-CACA混合基质溶液中CHCA的浓度为0.05～0.15mol/L。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤2中，待测还原糖的水溶液的点样体积为0.5～1.0μL；
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤2中，待测还原糖的水溶液和CHCA/3-CACA混合基质溶液的混匀使用
9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤3中，点样后的靶板在60℃下放置30min。
10.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤3中，所述的MALDI质谱分析采用的检测模式为正离子反射模式。
...【技术特征摘要】
1.α-氰基-3-氨基肉桂酸作为maldi反应型基质在还原糖分析中的应用。
2.α-氰基-3-氨基肉桂酸作为maldi反应型基质与α-氰基-4-羟基肉桂酸进行组合在还原糖分析中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的α-氰基-3-氨基肉桂酸如式(1)所示：
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的在还原糖分析中的应用为对还原糖进行高通量定性定量检测，具体包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤1中，所述的chca/3-caca混合基质溶液中3-caca的浓度为0.01～0.05mol/l。
6.根据权利要求4所述...
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