【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞辨识方法，更具体而言，涉及能够以高正确辨识率辨识稀少细胞的辨识方法。
技术介绍
1、一毫升血液样本中，细胞数小于1000颗的细胞可被归类为稀少细胞。诸如循环肿瘤细胞(ctcs)、胎儿有核红血球(fnrbcs)等稀少细胞可应用于医疗、检测分析等领域，诸如辅助癌症预后分析、产前检测或病毒感染检测分析等应用。
2、血液中稀少细胞的分选与辨识，临床上采用血液抹片的方式透过化学染色的方式在显微镜底下辨识是否存在目标细胞，然而由于根据这种方法分选与辨识目标细胞时，目标细胞相对于背景细胞(例如红血球或白血球)的数量比过低(大约1:107～109)，同时在使用特定抗体标定目标细胞以进行目标细胞的辨识时，目标细胞与抗体的结合率与准确率尚未满足临床鉴验的最低标准(99.5％)，因此需要建立更准确的辨识逻辑或分析方法。
技术实现思路
1、本专利技术提供一种细胞辨识方法，更具体而言，提供一种能够以高正确辨识率辨识稀少细胞的辨识方法。
2、本专利技术的一种细胞辨识方法，包括以下步骤。提供分析样品，分析样品含有目标细胞、非目标细胞与荧光标记物，荧光标记物包括用于标定细胞核的第一荧光标记物、用于标定目标细胞的第二荧光标记物以及用于标定目标细胞或非目标细胞的第三荧光标记物。分别以与第一荧光标记物对应的第一荧光波段、与第二荧光标记物对应的第二荧光波段及与第三荧光标记物对应的第三荧光波段对分析样品进行荧光扫描以取得分析样品在第一荧光波段、第二荧光波段及第三荧光波段下的第一荧光
3、根据本专利技术实施例，将同时在第一荧光影像照片及第二荧光影像照片中具有有效荧光信号的细胞标定为第一初步目标细胞。当第三荧光标记物用于标定目标细胞时，从第一初步目标细胞之中挑选，挑出在第三荧光影像照片中具有有效荧光信号的细胞筛选标定为第二初步目标细胞。或者，当第三荧光标记物用于标定非目标细胞时，从第一初步目标细胞之中挑选，挑出在第三荧光影像照片中不具有效荧光信号的细胞筛选标定为第二初步目标细胞。以白光对分析样品进行白光扫描以取得分析样品的白光影像照片，从第二初步目标细胞之中挑选，挑出具有特定细胞表型与形状的细胞进一步筛选辨识为目标细胞。
4、在本专利技术的一实施例中，上述的目标细胞为循环肿瘤细胞，第一荧光标记物为hoechst 33342，第二荧光标记物为带有荧光异硫氰酸盐(fluorescein isothiocyanate，fitc)的抗epcam抗体，且第三荧光标记物为带有藻红素(phycoerythrin，pe)的抗cd45抗体。
5、在本专利技术的一实施例中，上述的目标细胞为胎儿有核红血球，第一荧光标记物为4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，dapi)，第二荧光标记物为带有荧光异硫氰酸盐(fitc)的抗cd147抗体，且第三荧光标记物为带有藻红素(pe)的抗cd71抗体。
6、在本专利技术的一实施例中，上述的目标细胞为进行间质-上皮相互转换(epithelial-mesenchymal transition，emt)的细胞(又称简称emt细胞)，第一荧光标记物为hoechst 33342或dapi，第二荧光标记物为带有fitc的抗epcam抗体，且第三荧光标记物为带有pe的抗波形蛋白(vimentin)抗体。
7、在本专利技术的一实施例中，上述的第一荧光标记物为hoechst 33342，且第一荧光标记物的有效荧光信号的亮度范围为5-40。
8、在本专利技术的一实施例中，上述的第二荧光标记物为带有荧光异硫氰酸盐(fluorescein isothiocyanate，fitc)的抗epcam抗体，且第二荧光标记物的有效荧光信号的亮度范围为70-120。
9、在本专利技术的一实施例中，上述的第三荧光标记物为带有藻红素(phycoerythrin，pe)的抗cd45抗体，且第三荧光标记物的有效荧光信号的亮度范围为3-45。
10、在本专利技术的一实施例中，以白光对所述分析样品进行白光扫描以取得所述分析样品的白光影像照片，从第二初步目标细胞中进一步辨识筛选，将具有特定细胞表型与形状的细胞辨识为所述目标细胞的方法步骤包括：根据所取得白光影像照片，计算所标定的第二初步目标细胞各细胞的周长与面积，来决定所标定的第二初步目标细胞各细胞的形状与尺寸是否合乎所述目标细胞的标准形状，以进一步判定辨识所标定的第二初步细胞是否为目标细胞。
11、在本专利技术的一实施例中，上述的目标细胞的标准形状包括圆形或偏心率小于0.8的微椭圆形。
12、在本专利技术的一实施例中，其中将具有特定细胞表型与形状的所述第二初步目标细胞辨识为目标细胞的步骤包括：将所取得白光影像照片与第二荧光影像照片交叉比对，确认所述白光影像照片中所标定的第二初步目标细胞的细胞轮廓与第二荧光影像照片中的有效荧光信号所定位的细胞轮廓相对位置误差是否小于或等于所述目标细胞的直径的特定比例。
13、在本专利技术的一实施例中，上述的特定比例为所述目标细胞的直径的5％。
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1.一种细胞辨识方法，包括：
2.根据权利要求1所述的细胞辨识方法，其中所述目标细胞为循环肿瘤细胞，所述第一荧光标记物为Hoechst 33342，所述第二荧光标记物为带有荧光异硫氰酸盐(fluoresceinisothiocyanate，FITC)的抗EpCAM抗体，且所述第三荧光标记物为带有藻红素(phycoerythrin，PE)的抗CD45抗体。
3.根据权利要求1所述的细胞辨识方法，其中所述目标细胞为胎儿有核红血球，所述第一荧光标记物为4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)，所述第二荧光标记物为带有荧光异硫氰酸盐的抗CD147抗体，且所述第三荧光标记物为带有藻红素的抗CD71抗体。
4.根据权利要求1所述的细胞辨识方法，其中所述目标细胞为进行间质-上皮相互转换的细胞，所述第一荧光标记物为Hoechst 33342或4',6-二脒基-2-苯基吲哚，所述第二荧光标记物为带有荧光异硫氰酸盐的抗EpCAM抗体，且所述第三荧光标记物为带有藻红素的抗波形蛋白(vimentin)抗体。
5.根据权利要求1所述的细胞辨识方法，其中所述第一荧光标记物为Hoechst 33342，且所述第一荧光标记物的所述有效荧光信号的亮度范围为5-40。
6.根据权利要求1所述的细胞辨识方法，其中所述第二荧光标记物为带有荧光异硫氰酸盐的抗EpCAM抗体，且所述第二荧光标记物的所述有效荧光信号的亮度范围为70-120。
7.根据权利要求1所述的细胞辨识方法，其中所述第三荧光标记物为带有藻红素的抗CD45抗体，且所述第三荧光标记物的所述有效荧光信号的亮度范围为3-45。
8.根据权利要求1所述的细胞辨识方法，其中以白光对所述分析样品进行白光扫描以取得所述分析样品的白光影像照片，将具有特定细胞表型与形状的所述第二初步目标细胞辨识为所述目标细胞的步骤包括：根据所述分析样品的所述白光影像照片，计算所标定的第二初步目标细胞的周长与面积，来决定所标定的第二初步目标细胞的形状与尺寸，所述形状与尺寸符合所述目标细胞的标准形状，判定辨识为所述目标细胞。
9.根据权利要求8所述的细胞辨识方法，其中所述目标细胞的所述标准形状包括圆形或偏心率小于0.8的微椭圆形。
10.根据权利要求8所述的细胞辨识方法，其中将具有特定细胞表型与形状的所述第二初步目标细胞辨识为目标细胞的步骤更包括：将所取得白光影像照片与所述第二荧光影像照片交叉比对，比较所述白光影像照片中所标定的第二初步目标细胞的细胞轮廓以及所述第二荧光影像照片中的有效荧光信号所定位的细胞轮廓，两者轮廓相对位置误差小于或等于所述目标细胞的直径的特定比例，判定辨识为所述目标细胞。
11.根据权利要求10所述的细胞辨识方法，其中所述特定比例为所述目标细胞的直径的5％。
...【技术特征摘要】
1.一种细胞辨识方法，包括：
2.根据权利要求1所述的细胞辨识方法，其中所述目标细胞为循环肿瘤细胞，所述第一荧光标记物为hoechst 33342，所述第二荧光标记物为带有荧光异硫氰酸盐(fluoresceinisothiocyanate，fitc)的抗epcam抗体，且所述第三荧光标记物为带有藻红素(phycoerythrin，pe)的抗cd45抗体。
3.根据权利要求1所述的细胞辨识方法，其中所述目标细胞为胎儿有核红血球，所述第一荧光标记物为4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，dapi)，所述第二荧光标记物为带有荧光异硫氰酸盐的抗cd147抗体，且所述第三荧光标记物为带有藻红素的抗cd71抗体。
4.根据权利要求1所述的细胞辨识方法，其中所述目标细胞为进行间质-上皮相互转换的细胞，所述第一荧光标记物为hoechst 33342或4',6-二脒基-2-苯基吲哚，所述第二荧光标记物为带有荧光异硫氰酸盐的抗epcam抗体，且所述第三荧光标记物为带有藻红素的抗波形蛋白(vimentin)抗体。
5.根据权利要求1所述的细胞辨识方法，其中所述第一荧光标记物为hoechst 33342，且所述第一荧光标记物的所述有效荧光信号的亮度范围为5-40。
6.根据权利要求1所述的细胞辨识方法，其中所述第二荧光标记物为带有荧光异...
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