【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及基于pxjhe基因的m6a修饰水平及基因表达水平的小菜蛾对bt杀虫蛋白cry1ac抗性的检测方法及其试剂盒。
技术介绍
1、小菜蛾plutella xylostella(l.)，属于鳞翅目(lepidoptera)菜蛾科(plutellidae)，是一种世界性危害的十字花科蔬菜作物重大害虫，它以幼虫取食植物叶片进行危害，受灾害较为严重时可以造成植物只留下残存的主脉，因此，使蔬菜的产量和质量大大降低，目前，每年在全球至少造成40-50亿美元的巨额经济损失。苏云金芽胞杆菌(bacillus thuringiensis,bt)是一种革兰氏阳性杆状细菌，在形成芽胞的过程中能产生多种杀虫晶体蛋白，从而可以高效特异的杀死不同靶标害虫。因为bt具有对人畜环境无害且高效专一等特点，被广泛应用于小菜蛾的田间防治中，但小菜蛾在bt杀虫剂长时间的选择压下，进化出对bt杀虫剂的高抗性，这严重威胁了bt杀虫剂的有效利用。因此，小菜蛾bt抗性机制研究以及关键基因鉴定对于bt抗性检测、监测和预警提供理论支持，对bt制剂和转bt作物可持续推广应用和农民增产增收等方面具有重要的理论和实践意义。
2、昆虫的保幼激素(jh)在防止昆虫提前变态和促进生殖方面起着至关重要的作用。因此，保幼激素在血淋巴中的滴度会被严格调控。作为一个保幼激素负调控因子，保幼虫激素酯酶(jhe)在昆虫生长发育、滞育和繁殖过程中起着重要的调控作用，它在昆虫幼虫的最后一个阶段快速分解血淋巴中残留的jh，诱导幼虫到蛹的蜕变。
3、m6a rna甲
4、因此，建立一种简便、快速、十分准确和高效的小菜蛾bt抗性检测手段就显得尤为迫切，而为了更好的监测田间小菜蛾对bt杀虫蛋白cry1ac的抗性情况，开发出更有效的小菜蛾bt杀虫蛋白cry1ac抗性检测手段，我们开展了该研究内容。
技术实现思路
1、本专利技术人研究确定了m6a修饰在小菜蛾对bt杀虫蛋白cry1ac抗性中的潜在作用。本专利技术人发现小菜蛾的pxjhe基因的3′-utr区存在一个m6a修饰位点，并且发现bt杀虫蛋白cry1ac抗性小菜蛾的中肠组织中，此位点的m6a修饰水平相比较于敏感种群是显著升高的，m6a修饰水平的升高介导pxjhe的表达水平降低，从而使抗性小菜蛾的保幼激素水平升高，促使小菜蛾对bt杀虫蛋白cry1ac产生完美的高抗性。因此，专利技术人利用pxjhe的m6a水平及pxjhe基因的表达水平同时对小菜蛾的bt杀虫蛋白cry1ac抗性进行检测，建立一种快速准确的实时荧光定量pcr分子检测方法及准确、简便、高效的检测小菜蛾bt抗性的检测试剂盒，为小菜蛾bt抗性监测提供有效工具。
2、因此，本专利技术旨在提供一种十分准确且高效的小菜蛾对bt杀虫蛋白cry1ac抗性的检测方法及试剂盒。
3、首先，本专利技术提供一种基于pxjhe基因的m6a修饰水平和基因表达水平的小菜蛾对bt杀虫蛋白cry1ac抗性的检测试剂盒，其包括对于pxjhe基因的m6a修饰水平的检测试剂和其基因表达水平的检测试剂组成。
4、所述的检测试剂盒，进一步地，包含检测小菜蛾中pxjhe基因m6a修饰水平的特异性pcr引物对和检测小菜蛾中pxjhe基因表达量的特异性pcr引物对。
5、所述的检测试剂盒，优选地，检测小菜蛾中pxjhe基因m6a修饰水平的特异性pcr引物对的序列为：正向引物序列如seq id no.2所示，反向引物序列如seq id no.3所示；检测小菜蛾中pxjhe基因表达量的特异性pcr引物对的序列为：正向引物序列如seq id no.4所示，反向引物序列如seq id no.5所示。
6、本专利技术用于检测小菜蛾中pxjhe基因m6a修饰水平的特异性pcr引物对的获得方法如下：(1)以pxjhe基因的m6a位点为大致的中心，利用引物设计软件设计扩增片段为80-100bp的特异性引物对；(2)设计得到的引物需要在荧光定量pcr仪上进行扩增效率的检测，引物扩增在95％-105％之间，溶解曲线单一，并且pcr的产物测序为pxjhe基因的特异性片段，表明此引物可用于检测小菜蛾pxjhe基因m6a水平。
7、基于上述方法，专利技术人设计得到了可以用于检测pxjhe基因的m6a修饰水平的特异性引物对，正向引物序列如seq id no.2所示，反向引物序列如seq id no.3所示，它的扩增效率为98.6％，扩增片段为83bp，扩增产物为该扩增片段序列，且利用此特异性引物对可以有效的检测出小菜蛾pxjhe基因的m6a修饰水平，从而证明此引物对可以用于检测小菜蛾pxjhe基因的m6a修饰水平。
8、本专利技术用于检测小菜蛾pxjhe基因表达量的特异性pcr引物对的获得方法如下：(1)以小菜蛾pxjhe基因(序列如seq id no.1)的特异性片段区为靶目标序列，利用引物设计软件进行引物设计；(2)设计得到的引物需要在荧光定量pcr仪上进行扩增效率的检测，引物扩增在95％-105％之间，溶解曲线单一，并且pcr的产物测序为pxjhe基因的特异性片段表明此引物为可以pxjhe基因表达水平的特异性引物对。
9、基于上述方法，专利技术人设计得到了可以用于检测pxjhe基因表达水平的特异性引物对，正向引物序列如seq id no.4所示，反向引物序列如seq id no.5所示，它的扩增效率为98％，扩增片段为167bp，扩增产物为该扩增皮片段序列，且利用此特异性引物对可以有效的检测出小菜蛾pxjhe基因的表达水平，从而证明此引物对可以用于检测小菜蛾pxjhe基因的表达水平。
10、进一步地，所述的的检测试剂盒还包含内参基因rpl32特异性引物；优选采用荧光定量pcr进行检测；优选地，内参基因rpl32特异性引物的正向引物序列：5′-ccaatttaccgccctacc-3′；反向引物序列：5′-taccctgttgtcaatacctct-3′。
11、本专利技术提供所述的检测试剂盒在检测小菜蛾对bt杀虫蛋白cry1ac抗性中的应用。
12、同时，本专利技术还提供一种检测小菜蛾对bt杀虫蛋白cry1ac抗性的方法：对pxjhe基因的m6a修饰水平和基因表达水平均进行检测，以判断小菜蛾对bt杀虫蛋白cry1ac的抗性。
13、所述的方法，其是用本专利技术所述的检测试剂盒进行检测，并采用本专利技术所述的检测试剂盒的引物对进行荧光定量pcr，
14、其中，针对pxjhe基因的m6a修饰水平的检测的具体方法如下：(1)提取待测小菜蛾的中肠组织的rna样品，利用片段化试剂将其片段化，并本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于PxJHE基因的m6A修饰水平和基因表达水平的小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的检测试剂盒，其包括对于PxJHE基因的m6A修饰水平的检测试剂和其基因表达水平的检测试剂组成。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：包含检测小菜蛾中PxJHE基因m6A修饰水平的特异性PCR引物对和检测小菜蛾中PxJHE基因表达量的特异性PCR引物对。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：检测小菜蛾中PxJHE基因m6A修饰水平的特异性PCR引物对的序列为：正向引物序列如SEQ ID NO.2所示，反向引物序列如SEQID NO.3所示。
4. 根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：检测小菜蛾中PxJHE基因表达量的特异性PCR引物对的序列为：正向引物序列如SEQ ID NO.4所示，反向引物序列如SEQ IDNO.5所示。
5.根据权利要求4所述的的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含内参基因RPL32特异性引物；优选采用荧光定量PCR进行检测。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在
7.根据权利要求1至6任一项所述的检测试剂盒在检测小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性中的应用。
8.一种检测小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的方法，其特征在于，对PxJHE基因的m6A修饰水平和基因表达水平均进行检测，以判断小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac的抗性。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，其是用如权利要求1至6任一项所述的检测试剂盒进行检测，其采用如权利要求2所述的检测试剂盒的引物对进行荧光定量PCR，
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，利用所述的两对特异性引物同时进行小菜蛾Bt抗性检测，判断标准为：△Ctm6A值≤5.33且△Ct值≥16.14，则说明待测样品已对Bt杀虫蛋白一定产生抗性；若△Ctm6A值≥6.91且△Ct值≤14.01，则说明待测样品一定为敏感种群；若△Ctm6A值与△Ct值不在上述区间，则建议重做。
...【技术特征摘要】
1.一种基于pxjhe基因的m6a修饰水平和基因表达水平的小菜蛾对bt杀虫蛋白cry1ac抗性的检测试剂盒，其包括对于pxjhe基因的m6a修饰水平的检测试剂和其基因表达水平的检测试剂组成。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：包含检测小菜蛾中pxjhe基因m6a修饰水平的特异性pcr引物对和检测小菜蛾中pxjhe基因表达量的特异性pcr引物对。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：检测小菜蛾中pxjhe基因m6a修饰水平的特异性pcr引物对的序列为：正向引物序列如seq id no.2所示，反向引物序列如seqid no.3所示。
4. 根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：检测小菜蛾中pxjhe基因表达量的特异性pcr引物对的序列为：正向引物序列如seq id no.4所示，反向引物序列如seq idno.5所示。
5.根据权利要求4所述的的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含内参基因rpl32特异性引物；优选采用荧光定量pcr进行检测。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，...
【专利技术属性】
技术研发人员：张友军，郭兆将，白杨，张欣怡，郭乐，朱流红，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：
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