【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物学检测，具体涉及一种利用crispr-cas13a蛋白检测猫疱疹病毒的试剂盒及方法。
技术介绍
1、猫疱疹病毒（feline herpesvirus，fhv）是一种双链dna病毒，基因组大小约135800 bp，属于疱疹病毒目，疱疹病毒科，甲型疱疹病毒亚科，水痘病毒属。1958年crandell等首次从患有呼吸道疾病的幼猫体内分离得到该病毒。截至目前，猫疱疹病毒鉴定只有1个血清型，即fhv-1，该病毒已呈世界性流行。fhv-1是导致猫传染性鼻气管炎的病原体，临床症状主要表现为上呼吸道和眼部症状。该病幼猫较成年猫易感染，死亡率约50%，是一种急性高度接触性呼吸道传染病，也是目前最常见的猫呼吸道传染病之一。随着人们对伴侣动物需求的不断升温，国内宠物猫的饲养数量不断增加，由fhv-1导致的猫呼吸道和眼部疾病越来越常见。
2、目前常见检测fhv-1的方法主要包括病毒分离培养、免疫学方法、pcr等。传统的病毒分离培养存在周期较长，操作过程繁琐，漏检率高、程序复杂、所需试剂，已经远远不能满足现代的检测要求。免疫学方法存在灵敏度较差等问题，不能对疾病进行有效的早期诊断。pcr具有灵敏度和特异性高的特点，是目前检测fhv-1的金标准，但需要昂贵的检测设备，且存在整个检测过程时间稍长等不足。lamp方法克服了pcr技术需要昂贵的设备仪器等缺点，具有操作简便，结果判断简单等优点。但是，lamp技术要求多对引物且对靶基因的要求较高，设计比较繁琐，限制了其进一步的应用。重组酶聚合酶扩增（rpa）是一种快速兴起的恒温扩增技术
技术实现思路
1、基于此，本专利技术的目的在于克服上述现有技术的问题，提供了一种基于crispr-cas13a蛋白检测猫疱疹病毒的方法，可方便快速准确地鉴定猫疱疹病毒dna，操作简便，无需像pcr一样通过变温仪器来实现扩增检测，只需在37℃下进行等温扩增即可完成检测。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案予以实现：
3、本专利技术具体提供了一种基于crispr-cas13a蛋白检测猫疱疹病毒的试剂盒，该试剂盒包括rpa扩增引物组、crrna、cas13a蛋白和rna报告分子；其中，rpa扩增引物组是根据保守的猫疱疹病毒gd基因，设计特异检测猫疱疹病毒的上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如seq id no.1；下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示。在等温条件下进行，10-60分钟内，即可检测出猫疱疹病毒。
4、进一步地，crrna的核酸序列如seq id no.3所示。
5、进一步地，rna报告分子序列为：荧光基团-uuuuu-淬灭基团，荧光报告基团为fam、hex、tet、joe或vic；荧光淬灭基团为bhq1、bhq2或bhq3。
6、更进一步地，5＇端修饰fma荧光基团，3＇端修饰bhq1淬灭基团。
7、进一步地，cas13a蛋白为lwacas13a。
8、本专利技术的另一个目的是提供一种基于crispr-cas13a蛋白检测猫疱疹病毒的方法，包括以下步骤：
9、步骤1：设计并合成rpa扩增的引物；
10、步骤2：计并合成cas13a蛋白的crrn；
11、步骤3：设计并合成rna报告分子；
12、步骤4：设计并合成阳性质粒；
13、步骤5：制备阳性质粒；
14、步骤6：配制扩增体系；
15、步骤7：crispr-cas13a蛋白检测。
16、进一步地，步骤1的具体操作为：根据保守的猫疱疹病毒gd基因，设计特异检测猫疱疹病毒的上游引物和下游引物，将设计好的所述上游引物和所述下游引物在ncbi中进行blast，显示是特异的猫疱疹病毒序列；其中，上游引物的核苷酸序列如seq id no.1所示；下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示；猫疱疹病毒gd基因的序列如seq id no.4所示。
17、更进一步地，步骤2的具体操作：根据cas13a蛋白的特点，在扩增的基因片段序列直接设计特异识别猫疱疹病毒的crrna，在ncbi中进行blast，显示是特异的gd基因序列；crrna的核酸序列如seq id no.3所示。
18、更进一步地，步骤3的具体操作：根据cas13a蛋白的特点，设计的rna报告分子，rna报告分子的序列为荧光报告基团-uuuuu-荧光淬灭基团，其中，荧光报告基团为fam、hex、tet、joe或vic；荧光淬灭基团为bhq1、bhq2或bhq3。
19、更进一步地，rna报告分子的序列为fam-uuuuu-bhq1，5＇端修饰fma荧光基团，3＇端修饰bhq1淬灭基团。
20、更进一步地，步骤4的具体操作：将猫疱疹病毒gd基因的核酸序列克隆到puc57质粒中，克隆位点为sami，抗性为氨苄抗性，克隆菌株为dh5α。
21、更进一步地，步骤5的具体操作：将步骤4获得的所述阳性质粒，以1%接种量，接种到含有100 μg/ml氨苄的lb培养基中，在摇床中37℃，220 rpm过夜培养；吸取菌液，采用天根质粒提取试剂盒提取质粒，使用nanodrop 2000测浓度，计算拷贝数，进行系列梯度稀释，以备后续使用。
22、更进一步地，步骤6中的扩增检测体系（50 μl反应体系）包括如下组分与用量：
23、rpa缓冲液 29.5 μl；
24、上游引物（10 μm） 2.1 μl；
25、下游引物（10 μm） 2.1 μl；
26、核酸模板+双蒸水 13.8 μl；
27、醋酸镁（280 mm） 2.5 μl。
28、更进一步地，步骤7中crispr-cas13a检测体系（20 μl反应体系）包括如下组分与用量：
29、neb buffer r2.1（10×） 2 μl；
30、t7 rna polymerase 0.5 µl
31、cas13a蛋白（10mg/ml） 0.5 μl；
32、rna报告分子（10 μm） 1 μl；
33、ntps（10 mm） 2 μl
34、crrna（5 μm） 0.4 μl；
35、检测产物+双蒸水 13.6 μl。
36、更进一步地，步骤7中各组分混合均匀后，通过荧光检测仪测试反应并观察结果，温度设置为37℃。
37、与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：
38、本专利技术设计的试剂盒只需要在等温条件下，10-60分钟内，即可准确地检测出猫疱疹病毒毒dna，具本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于CRISPR-Cas13a蛋白检测猫疱疹病毒的试剂盒，其特征在于，试剂盒包括RPA扩增引物组、crRNA、Cas13a蛋白和RNA报告分子；其中，RPA扩增引物组是根据保守的猫疱疹病毒gD基因，设计特异检测猫疱疹病毒的上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR-Cas13a蛋白检测猫疱疹病毒的试剂盒，其特征在于，crRNA的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR-Cas13a蛋白检测猫疱疹病毒的试剂盒，其特征在于，RNA报告分子序列为：荧光基团-UUUUU-淬灭基团，荧光报告基团为FAM、HEX、TET、JOE或VIC；荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2或BHQ3。
4.一种基于CRISPR-Cas13a蛋白检测猫疱疹病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的一种基于CRISPR-Cas13a蛋白检测猫疱疹病毒的方法，其特征在于，步骤1的
6.根据权利要求5所述的一种基于CRISPR-Cas13a蛋白检测猫疱疹病毒的方法，其特征在于，步骤2的具体操作：根据Cas13a蛋白的特点，在扩增的基因片段序列直接设计特异识别猫疱疹病毒的crRNA，在NCBI中进行blast，显示是特异的gD基因序列；crRNA的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。
7.根据权利要求6所述的一种基于CRISPR-Cas13a蛋白检测猫疱疹病毒的方法，其特征在于，步骤3的具体操作：根据Cas13a蛋白的特点，设计的RNA报告分子，RNA报告分子的序列为荧光报告基团-UUUUU-荧光淬灭基团，其中，荧光报告基团为FAM、HEX、TET、JOE或VIC；荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2或BHQ3。
8.根据权利要求7所述的一种基于CRISPR-Cas13a蛋白检测猫疱疹病毒的方法，其特征在于，步骤4的具体操作：将猫疱疹病毒gD基因的核酸序列克隆到pUc57质粒中，克隆位点为SamI，抗性为氨苄抗性，克隆菌株为DH5α。
9.根据权利要求8所述的一种基于CRISPR-Cas13a蛋白检测猫疱疹病毒的方法，其特征在于，步骤7中CRISPR-Cas13a检测体系包括如下组分与用量：
10.根据权利要求9所述的一种基于CRISPR-Cas13a蛋白检测猫疱疹病毒的方法，其特征在于，步骤7中各组分混合均匀后，通过荧光检测仪测试反应并观察结果，温度设置为37℃。
...【技术特征摘要】
1.一种基于crispr-cas13a蛋白检测猫疱疹病毒的试剂盒，其特征在于，试剂盒包括rpa扩增引物组、crrna、cas13a蛋白和rna报告分子；其中，rpa扩增引物组是根据保守的猫疱疹病毒gd基因，设计特异检测猫疱疹病毒的上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如seq id no.1；下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示。
2.根据权利要求1所述的一种基于crispr-cas13a蛋白检测猫疱疹病毒的试剂盒，其特征在于，crrna的核酸序列如seq id no.3所示。
3.根据权利要求1所述的一种基于crispr-cas13a蛋白检测猫疱疹病毒的试剂盒，其特征在于，rna报告分子序列为：荧光基团-uuuuu-淬灭基团，荧光报告基团为fam、hex、tet、joe或vic；荧光淬灭基团为bhq1、bhq2或bhq3。
4.一种基于crispr-cas13a蛋白检测猫疱疹病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的一种基于crispr-cas13a蛋白检测猫疱疹病毒的方法，其特征在于，步骤1的具体操作为：根据保守的猫疱疹病毒gd基因，设计特异检测猫疱疹病毒的上游引物和下游引物，将设计好的所述上游引物和所述下游引物在ncbi中进行blast，显示是特异的猫疱疹病毒序列；其中，上游引物的核苷酸序列如seq id no.1所示；下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示；猫疱疹病毒gd基因的...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋绍征，颜文，顾乐盈，孟雅琴，钟小惠，
申请(专利权)人：无锡太湖学院，
类型：发明
国别省市：
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