【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因治疗和肿瘤免疫治疗，涉及局部分泌表达pd-l1单链抗体的重组溶瘤腺病毒及应用。是能在肿瘤局部分泌表达pd-l1单链抗体的重组溶瘤腺病毒zd55-apd-l1scfv的构建、扩增、纯化、体外阻断pd-l1抗原表位的验证、体外促进人pbmc对肿瘤细胞生长抑制作用分析和小鼠体内抑制肿瘤生长作用分析，揭示了肿瘤局部分泌表达pd-l1单链抗体的重组溶瘤腺病毒在肿瘤药物开发中的应用前景。
技术介绍
1、程序性细胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1，pd-1)，由位于第2q37.3号染色体上的pdcd1基因编码，是具有288个氨基酸的ⅰ型跨膜蛋白，属于cd28超家族中的一员，主要表达在活化免疫细胞，如t细胞、自然杀伤性细胞(nk细胞)和b细胞表面，主要起到调节外周耐受性和自身免疫的作用。
2、pd-l1(cd274，b7-h1)由位于第9p.24.1号染色体上的cd274基因编码，是pd-1(cd279)的配体。pd-l1主要表达在抗原呈递细胞(apc)、树突状细胞(dc)、巨噬细胞、活化的单核细胞、自然杀伤(nk)细胞、t细胞、b细胞、上皮细胞、血管内皮细胞、神经胶质细胞和肿瘤细胞，细胞因子ifn-γ能诱导多种肿瘤细胞表达pd-l1。
3、在机体免疫应答过程中，免疫检查点信号通路能够负调节免疫细胞的活性，使免疫应答更准确。活化的t细胞表面会表达pd-1，当pd-1结合靶细胞表面的配体pd-l1或pd-l2时，会激活t细胞一系列抑制信号，通过包括阻止增殖、诱导凋
4、针对肿瘤细胞利用pd-1/pd-l1免疫检查点信号通路进行免疫逃逸的现象，可以通过用抑制剂阻断pd-1和pd-l1的相互作用，恢复效应t细胞的活性。目前已经有多种pd-1和pd-l1抗体阻断抑制剂被批准用于临床治疗，包括pd-1阻断抗体纳武利尤单抗、帕博利珠单抗、西米普利单抗、信替利单抗、卡瑞利珠单抗、特瑞利单抗、替利珠单抗、津贝利单抗、普罗戈利单抗和多斯塔利单抗；pd-l1阻断抗体阿特珠单抗(atezolizumab)、度伐利尤单抗(durvalumab)和阿维鲁单抗(avelumab)。
5、然而，尽管pd-1/pd-l1阻断抗体在一些患者治疗中展现出了抗肿瘤作用，但是依然有大部分患者无法从pd-1/pd-l1阻断治疗中获益，患者应答率低。因为pd-1/pd-l1免疫检查点不是抗肿瘤免疫应答中唯一的限速步骤，很多肿瘤本身缺少免疫应答，被称为“冷肿瘤”，效应免疫细胞浸润少，尤其是免疫原性低的三阴性乳腺癌、肾癌、宫颈癌和胶质瘤等。所以，需要寻找能提升患者对pd-1/pd-l1阻断疗法应答率的治疗策略。
6、此外，临床报告显示全身系统性递送pd-1/pd-l1抑制剂在患者中出现12％-37％的免疫相关的毒副作用事件，其中一些事件甚至危及患者生命安全。这主要是由于全身系统性递送pd-1/pd-l1抑制剂会导致效应t细胞的过度活化而导致。因此如何降低因全身系统性递送免疫检查点抑制剂造成的毒副作用也是需要我们研究解决的问题之一。
7、溶瘤病毒疗法是潜在提升患者对pd-1/pd-l1阻断疗法应答率和降低因全身性递送抑制剂造成的毒副作用的治疗策略。溶瘤病毒是一类天然存在或经过基因改造的病毒，能选择性的在肿瘤细胞复制并裂解杀死肿瘤细胞，裂解肿瘤细胞的同时能产生肿瘤相关抗原进一步激活全身性抗肿瘤免疫。目前，常见研究的溶瘤病毒类型有腺病毒(adenovirus)、单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)、痘苗病毒(vaccinia virus)、柯萨奇病毒(coxsackievirus)、麻疹病毒(measles virus)、细小病毒(parvovirus)和新城疫病毒(newcastledisease virus)等。
8、腺病毒是一种没有包膜的双链线性dna病毒，基因组长约36kb，外面主要有纤毛、五邻体和六邻体蛋白组成的二十面体衣壳包裹，病毒颗粒直径约为80-110nm。自上世纪50年代发现腺病毒以来，已陆续分离到52种不同血清型(serotype)人腺病毒，可以分为a～g七个亚群(subgroup)，其中2型和5型腺病毒研究较多，5型腺病毒应用最广泛，包括疫苗、基因治疗和肿瘤治疗。两者在血清学分类上属于c亚群，在dna序列上有95％的同源性。病毒基因组分为编码区和非编码区，其中编码区有与腺病毒遗传物质复制修饰等过程密切相关的5个早期转录单位(e1～e4)，2个延迟转录单位(ⅸ和iva2)和一个与病毒颗粒组装密切相关的晚期转录单位(l1～l5)。早期转录单位e1～e4参与调控晚期转录单位l1～l5，只有当早期转录单位积累到一定量时才启动晚期转录单位的转录表达，所以可以通过对早期转录单位e1～e4的调控来控制病毒复制。目前，研究较多的为e1a基因，该基因是最早转录表达的一个蛋白，且e1a蛋白参与了病毒整个基因组复制的过程，所以可以通过修饰调控e1a基因的转录表达来控制病毒的复制。腺病毒a～g七个亚群除了遗传物质有一定程度上的差异外，与细胞的结合靶点和进入细胞的途径也存在差异。5型腺病毒感染细胞过程中首先通过与细胞膜上的柯萨奇-腺病毒受体(coxsackie and adenovirus receptor，car)结合，从而粘附在靶细胞表面，再通过五邻体基座上的多肽序列精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸(arg-gly-asp，rgd)与细胞表面整合素αvβ3和αvβ5相互作用，形成质膜囊泡内吞病毒进入细胞，病毒基因组脱衣壳通过核孔进入细胞核进行转录和复制。
9、腺病毒的优势：安全性高，病毒基因组不会整合到宿主基因组上，降低了基因突变和致癌的风险；基因组容量大，允许非必要基因的删除和允许多个外源基因的插入；靶向性强，可以从多个维度修饰控制其靶向性；静息期和分裂期的细胞都能有效感染；病毒复制能力强，容易获得较高产量的病毒等。所以腺病毒作为理想的基因递送载体和溶瘤病毒的候选对象受到广泛关注。
10、综上所述，溶瘤病毒可以激活机体的免疫，改善肿瘤免疫抑制微环境，使“冷肿瘤”变成“热肿瘤”，联合免疫检查点抑制剂能产生更好的疗效。但考虑到全身性递送免疫检查点阻断抗体的用药剂量高、经济成本高、毒副作用大，而单链抗体具有全长抗体相似的结合能力以及分子量小更有利于在致密的实体瘤内部穿梭等优点，利用溶瘤腺病毒在肿瘤局部表达pd-l1阻断抗体是否比单独的溶瘤病毒或溶瘤病毒联合pd-l1全长阻断抗体会有更强的抗肿瘤作用？针对这一问题，本专利技术构建了能在肿瘤局部分泌表达pd-l1单链抗体的重组溶瘤腺病zd55-apd-l1 scfv，探究重组溶瘤腺病毒zd55-apd-l1 scfv在体内外的抗肿瘤作用。
技术实现思路
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【技术保护点】
1.一种局部分泌表达PD-L1单链抗体的重组溶瘤腺病毒ZD55-aPD-L1 scFv，其特征在于，
2.权利要求1所述重组溶瘤腺病毒ZD55-aPD-L1 scFv在制备免疫治疗PD-L1阳性的肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述应用是ZD55-aPD-L1 scFv在肿瘤局部分泌表达PD-L1单链阻断抗体，通过促进淋巴细胞在肿瘤中的浸润和阻断PD-1:PD-L1信号通路，增强效应T淋巴细胞对肿瘤生长的抑制作用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为三阴性乳腺癌、黑色素瘤。
【技术特征摘要】
1.一种局部分泌表达pd-l1单链抗体的重组溶瘤腺病毒zd55-apd-l1 scfv，其特征在于，
2.权利要求1所述重组溶瘤腺病毒zd55-apd-l1 scfv在制备免疫治疗pd-l1阳性的肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述应用是zd55-a...
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