本发明专利技术公开了一种检测外泌体蛋白的方法以及检测试剂盒。该方法为：采用嗜硫磁珠作为载体，与带有二硫键长臂生物素的外泌体蛋白抗体1进行偶联，利用夹心法再连接外泌体蛋白抗体2‑发光标记物试剂形成偶联复合物，对外泌体蛋白进行化学发光检测时，在加入发光激发液之前使用二硫键解离试剂去除磁珠，然后进行外泌体蛋白的化学发光检测。本发明专利技术提供的检测方法使外泌体既能充分裂解、高效进行抗体抗原反应，同时不影响后续化学发光检测；避免了磁珠对检测结果的干扰，保证高灵敏的检测效果。
1、外泌体是一种囊泡状的有脂质双层膜结构的小泡，典型的外泌体有茶托样的外形，且由绝大多数细胞内出芽分泌而出。外泌体的直径30-200nm左右，由于体积小，可以在体液、血液等液体中自由流动。诸多学者从外泌体的蛋白质组学、转录组学等多角度研究，显示外泌体内有非常丰富的内容物，有众多的跨膜蛋白、膜内蛋白、dna、rna等。对于外泌体的功能研究结果显示出，外泌体作为细胞与细胞之间沟通的载体，参与了众多的生物学过程，包括炎症反应、调控因子转移等。最重要的是，癌症作为全球致死性比较多的疾病，其发生发展、转移、侵袭的过程中，外泌体居然也起了非常关键的作用。所以对于肿瘤诊疗研究，外泌体也有非常重大的研究价值。外泌体包含许多与肿瘤研究相关的蛋白质，尤其是临床用药指导相关的蛋白质，如pd-l1蛋白、alk蛋白、her2蛋白等也有表达。
2、对于外泌体蛋白的检测方法主要有免疫组织化学法检测、原位杂交法检测、实时荧光定量pcr、fish、二代测序、elisa法等。以外泌体her2蛋白为例，在研究过程中使用elisa检测方法我们发现裂解后的外泌体her2蛋白比外泌体表面的her2蛋白表达量更多，但是在对裂解以后的外泌体进行磁珠法化学发光检测her2蛋白时发现裂解体系内的偶联磁珠对检测体系影响非常大。为了提高检测的灵敏性，使用化学发光法能够检测到外泌体总her2蛋白表达情况，如何实现适量的血浆中高灵敏的外泌体总her2蛋白检测，是目前需要解决的问题。
/>技术实现思路
1、本专利技术的目的是，提供一种检测外泌体蛋白的方法及检测试剂盒。主要解决现有技术中外泌体膜上和膜内总蛋白检测灵敏度不高的技术问题。
2、本专利技术为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
3、一种检测外泌体蛋白的方法，该方法为：采用嗜硫磁珠作为载体，与带有二硫键长臂生物素的外泌体蛋白抗体1进行偶联，与目标蛋白结合后利用夹心法再连接外泌体蛋白抗体2-发光标记物试剂形成偶联复合物，对外泌体蛋白进行化学发光检测时，在加入发光激发液之前使用二硫键解离试剂去除磁珠，然后进行外泌体蛋白的化学发光检测。
4、本专利技术中所述的蛋白抗体1、蛋白抗体2是指与目标蛋白免疫结合的两种不同表位的抗体，抗体不同，但是免疫结合的目标蛋白是同一个。
5、作为优选实施方案，所述方法包括如下步骤：
6、步骤1，对外泌体进行裂解，将裂解液与嗜硫磁珠-二硫键长臂生物素-蛋白抗体1进行孵育，得到复合物：嗜硫磁珠-二硫键长臂生物素-蛋白抗体1-目标蛋白；
7、步骤2，将步骤1中得到的复合物与蛋白抗体2-发光标记物进行偶联，得到偶联复合物：嗜硫磁珠-二硫键长臂生物素-蛋白抗体1-目标蛋白-蛋白抗体2-发光标记物；
8、步骤3，将步骤2中得到的偶联复合物采用二硫键解离试剂切掉二硫键，去除偶联复合物中的嗜硫磁珠，得到检测目标物；
9、步骤4，将步骤3中得到的检测目标物采用化学发光法进行检测，通过检测发光值实现对目标蛋白的检测。
10、作为优选实施方案，所述发光标记物为吖啶酯。
11、作为优选实施方案，所述目标蛋白为外泌体膜上和膜内都有表达的蛋白。
12、作为优选实施方案，所述目标蛋白为外泌体的her2蛋白、alk蛋白、pd-l1蛋白或cd9蛋白。
13、本专利技术还提供一种外泌体蛋白的检测试剂盒，该试剂盒包括：抗体磁珠偶联试剂、化学发光偶联试剂、二硫键解离试剂、激发液；所述抗体磁珠偶联试剂包括嗜硫磁珠-二硫键长臂生物素-蛋白抗体1的复合物，所述化学发光偶联试剂包括蛋白抗体2-发光标记物的复合物；所述抗体磁珠偶联试剂中的复合物与样本中的目标蛋白结合，再与化学发光偶联试剂中的复合物结合形成偶联复合物，在加入激发液进行检测之前加入二硫键解离试剂去除检测液中的嗜硫磁珠。
14、作为优选实施方案，所述抗体磁珠偶联试剂的组成为：6.2-8.9g/ltris，4.75-7.63g/l氯化钠，0.25-0.81mg/ml嗜硫磁珠-二硫键长臂生物素-蛋白抗体1的复合物，其中蛋白抗体1的浓度为0.19-0.54μg/ml，ph:7.5-8.0，溶剂为水。
15、所述蛋白抗体1中的蛋白以her2蛋白为例，其组成优选为：7.6g/l的tris，6.8g/l的氯化钠，0.63mg/ml的her2磁珠偶联复合物(嗜硫磁珠-二硫键长臂生物素-her2抗体1的复合物)，其中her2抗体1的浓度为0.41μg/ml，ph:7.6，溶剂为水。
16、具体地，嗜硫磁珠-二硫键长臂生物素-her2抗体1的复合物的制备方法为：7.6g/l的tris，6.8g/l的氯化钠，0.19-0.54μg/ml的二硫键长臂生物素-her2抗体1偶联复合物，0.25-0.61mg/ml的嗜硫磁珠，4mg/ml的s-nhs，5mg/ml的edc充分震荡混匀，37℃条件下震荡孵育15min，制备获得her2磁珠偶联试剂。嗜硫磁珠-二硫键长臂生物素-her2抗体1的复合物优选为0.63mg/ml。其中的二硫键长臂生物素-her2抗体1偶联复合物为自行制备。
17、二硫键长臂生物素-her2抗体1偶联复合物制备过程如下：
18、二硫键长臂生物素-her2抗体1的制备：二硫键长臂生物素用无菌水配制成5g/l的溶液，将10μl二硫键长臂生物素溶液缓慢加入1ml(1mg/ml)her2抗体1中，室温下避光旋转反应1h。反应结束后，用1×pbs(ph:7.2)透析过夜，次日，换液继续透析5h。透析结束后，收集并分装，酶标仪定量蛋白。
19、作为优选实施方案，所述化学发光偶联试剂的组成为：2.8-6.7g/l磷酸二氢钠、1.5-4.3g/l磷酸氢二钠、3.2-8.4g/l氯化钠、0.03-0.47g/lf-127，0.54-0.87mg/ml蛋白抗体2-发光标记物，ph:6.0～6.8，溶剂为水。
20、所述蛋白抗体2-发光标记物中的蛋白以her2蛋白为例，其组成优选为：4.6g/l磷酸二氢钠、3.1g/l磷酸氢二钠、3.9g/l氯化钠、0.13g/lf-127，0.73mg/ml her2抗体2-ae偶联复合物，ph:6.5，溶剂为水。
21、具体地，her2抗体2-ae偶联试剂的制备方法为：(1)将her2抗体2用nahco3缓冲液溶解；优选的，nahco3缓冲液的ph:8.2-9.0；(2)加入7～13倍质量浓度吖啶酯(ae)；优选的，加入10倍质量浓度吖啶酯(ae)；(3)ph:7.0-7.5的缓冲液平衡脱盐纯化柱；用脱盐纯化柱过滤掉游离的吖啶酯。(4)过滤得到的her2抗体2-ae偶联复合物采用her2抗体2蛋白工作液缓冲液稀释。蛋白工作液缓冲液体系为：2.5-5.9g/l磷酸二氢钠、2.1-5.3g/l磷酸氢二钠、3.2-9.1g/l氯化钠、0.02-0.41g/lf-12本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测外泌体蛋白的方法，该方法为：采用嗜硫磁珠作为载体，与带有二硫键长臂生物素的外泌体蛋白抗体1进行偶联，与目标蛋白结合后利用夹心法再连接外泌体蛋白抗体2-发光标记物试剂形成偶联复合物，对外泌体蛋白进行化学发光检测时，在加入发光激发液之前使用二硫键解离试剂去除磁珠，然后进行外泌体蛋白的化学发光检测。
2.根据权利要求1所述的检测外泌体蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
3.根据权利要求1或2所述的检测外泌体蛋白的方法，其特征在于：所述发光标记物为吖啶酯。
4.根据权利要求2所述的检测外泌体蛋白的方法，其特征在于：所述目标蛋白为外泌体膜上和膜内都有表达的蛋白。
5.根据权利要求4所述的检测外泌体蛋白的方法，其特征在于：所述目标蛋白为外泌体的HER2蛋白、ALK蛋白、PD-L1蛋白或CD9蛋白。
6.一种外泌体蛋白的检测试剂盒，该试剂盒包括：抗体磁珠偶联试剂、化学发光偶联试剂、二硫键解离试剂、激发液；所述抗体磁珠偶联试剂包括嗜硫磁珠-二硫键长臂生物素-蛋白抗体1的复合物，所述化学发光偶联试剂包括蛋白抗体2-发光标记物的复合物；所述抗体磁珠偶联试剂中的复合物与样本中的目标蛋白结合，再与化学发光偶联试剂中的复合物结合形成偶联复合物，在加入激发液进行检测之前加入二硫键解离试剂去除检测液中的嗜硫磁珠。
7.根据权利要求6中的检测试剂盒，其特征在于，所述抗体磁珠偶联试剂的组成为：6.2-8.9g/LTris，4.75-7.63g/L氯化钠，0.25-0.81mg/mL嗜硫磁珠-二硫键长臂生物素-蛋白抗体1的复合物，其中蛋白抗体1的浓度为0.19-0.54μg/mL，PH:7.5-8.0，溶剂为水。
8.根据权利要求6中的检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光偶联试剂的组成为：2.8-6.7g/L磷酸二氢钠、1.5-4.3g/L磷酸氢二钠、3.2-8.4g/L氯化钠、0.03-0.47g/LF-127，0.54-0.87mg/mL蛋白抗体2-发光标记物，PH:6.0～6.8，溶剂为水。
9.根据权利要求6中的检测试剂盒，其特征在于，所述二硫键解离试剂的组成为：0.04M-0.22M TCEP，9-19mM的DTT，溶剂为水。
10.根据权利要求6中的检测试剂盒，其特征在于，所述激发液由激发液A和激发液B组成，所述激发液A的组成为：体积比0.03-0.4％的过氧化氢和0.2-0.5M的HNO3，溶剂为水；所述激发液B的组成为：0.05-0.5M的氢氧化钠和0.1-1.0mL/L的Tween-20，溶剂为水。
11.根据权利要求6中的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括：CD9磁珠偶联试剂、外泌体裂解液、洗涤试剂Ⅰ、洗涤试剂Ⅱ、洗涤试剂Ⅲ、洗涤试剂Ⅳ、PBST缓冲液、PBS缓冲液；其中，CD9磁珠偶联试剂的组成为：6.2-8.9g/L的Tris，5.8-8.1g/L的氯化钠，0.4-0.6mg/mL的磁珠-CD9抗体偶联物，其中CD9抗体的浓度为0.2-0.4μg/mL，PH:7.5-8.0，溶剂为水；所述外泌体裂解液的组成为：2.5-5.0g/L的三羟甲基氨基甲烷，5.0-7.5g/L的氯化钠，体积百分比为0.6-6.5％的甘油，体积百分比为0.3-5％的NP-40，0.02-0.5M的柠檬酸盐，溶剂为水；所述洗涤试剂Ⅰ的组成为：5.5-9.5g/L的2-吗啉乙磺酸-水合物，溶剂为水；所述洗涤试剂Ⅱ的组成为：6.5-9.5g/L的三羟甲基氨基甲烷，4.0-6.5g/L的氯化钠，0.1-0.6mL/L的Tween-20，溶剂为水；所述洗涤试剂Ⅲ的组成为：6.5-8.5g/L的三羟甲基氨基甲烷，5.0-7.5g/L的氯化钠，0.1-0.6mL/L的Tween-20，溶剂为水；所述洗涤试剂Ⅳ的组成为：7.2-9.5g/L的三羟甲基氨基甲烷，5.0-8.5g/L的氯化钠，溶剂为水。
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【技术特征摘要】
1.一种检测外泌体蛋白的方法，该方法为：采用嗜硫磁珠作为载体，与带有二硫键长臂生物素的外泌体蛋白抗体1进行偶联，与目标蛋白结合后利用夹心法再连接外泌体蛋白抗体2-发光标记物试剂形成偶联复合物，对外泌体蛋白进行化学发光检测时，在加入发光激发液之前使用二硫键解离试剂去除磁珠，然后进行外泌体蛋白的化学发光检测。
2.根据权利要求1所述的检测外泌体蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
3.根据权利要求1或2所述的检测外泌体蛋白的方法，其特征在于：所述发光标记物为吖啶酯。
4.根据权利要求2所述的检测外泌体蛋白的方法，其特征在于：所述目标蛋白为外泌体膜上和膜内都有表达的蛋白。
5.根据权利要求4所述的检测外泌体蛋白的方法，其特征在于：所述目标蛋白为外泌体的her2蛋白、alk蛋白、pd-l1蛋白或cd9蛋白。
6.一种外泌体蛋白的检测试剂盒，该试剂盒包括：抗体磁珠偶联试剂、化学发光偶联试剂、二硫键解离试剂、激发液；所述抗体磁珠偶联试剂包括嗜硫磁珠-二硫键长臂生物素-蛋白抗体1的复合物，所述化学发光偶联试剂包括蛋白抗体2-发光标记物的复合物；所述抗体磁珠偶联试剂中的复合物与样本中的目标蛋白结合，再与化学发光偶联试剂中的复合物结合形成偶联复合物，在加入激发液进行检测之前加入二硫键解离试剂去除检测液中的嗜硫磁珠。
7.根据权利要求6中的检测试剂盒，其特征在于，所述抗体磁珠偶联试剂的组成为：6.2-8.9g/ltris，4.75-7.63g/l氯化钠，0.25-0.81mg/ml嗜硫磁珠-二硫键长臂生物素-蛋白抗体1的复合物，其中蛋白抗体1的浓度为0.19-0.54μg/ml，ph:7.5-8.0，溶剂为水。
8.根据权利要求6中的检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光偶联试剂的组成为：2.8-6.7g/l磷酸二氢钠、1.5-4.3g/l磷酸氢二钠、3.2-8.4g/l氯化钠、0...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵小玉，马跃，张亚楠，
申请(专利权)人：上海思路迪生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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