【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，尤其涉及一种大豆免疫防御基因及其蛋白质和应用。
技术介绍
1、作为豆科植物从自然界中获取氮素的主要途径，豆科植物-根瘤菌的共生固氮过程强弱与前者的产量高低是有最直接影响的；从菌植互作的角度来看，根瘤菌的早期侵染以及豆科植物的早期识别作为整个共生过程的开始，其重要性可见一斑；土壤中的根瘤菌在受到类黄酮诱导后向宿主植物的根部聚集，并通过分泌各种结瘤因子，从而促进根瘤菌侵入到植物根部细胞中，但是根瘤菌分泌的结瘤因子对于宿主植物来说则是外来抗原物质，因此豆科植物在识别这些结瘤信号的时候同时会触发免疫防御反应，而这无疑是会抑制结瘤信号的传导，进而影响整个共生结瘤过程；因此如果能够通过基因工程的方法减弱宿主植物在根瘤菌侵染后触发的早期免疫防御强度，或许能使根瘤菌更好的与豆科植物共生，从而达到后者提高产量的目的。
2、而目前有关研究方向主要集中在提高作物对病虫害抗性的基因上，但这些基因所编码的蛋白从本质上来说并没有参与到豆科植物-根瘤菌共生固氮过程中，因此也无法从根本上提高大豆产量；
3、病程相关蛋白1(pathogenesis-related protein 1,pr-1)是植物免疫防御反应的核心组成部分，在植物防御中起着重要作用，多数研究中都会用其表达量的高低来证明植物免疫强度的强弱，但病程相关蛋白pr-1在豆科植物-根瘤菌共生免疫过程中具体行使功能的方式是未知的，因此，本专利技术提出一种大豆免疫防御基因及其蛋白质和应用以解决现有技术中存在的问题。
技术实现思路<
1、针对上述问题，本专利技术的目的在于提出一种大豆免疫防御基因及其蛋白质和应用，该大豆免疫防御基因及其蛋白质和应用提出的大豆病程相关基因gmpr-1是一个编码参与植物免疫防御反应核心蛋白的基因，并且通过过表达gmpr-1基因，能够影响豆科植物在根瘤菌侵染时触发的早期免疫防御反应，进而提高共生结瘤和固氮能力，也能够增加单颗根瘤的瘤重和大小，提高大豆根瘤总重量和植株地上部分生物量。
2、为实现本专利技术的目的，本专利技术通过以下技术方案实现：一种大豆免疫防御基因及其蛋白质和应用，包括所述大豆-根瘤菌共生免疫防御gmpr-1基因从大豆品系wiliams82中使用引物对pr-1-f/r克隆获得，所述gmpr-1基因核苷酸序列如seq id no.1所示，所述gmpr-1蛋白质氨基酸序列如seq id no.2所示。
3、进一步改进在于：所述大豆-根瘤菌共生免疫防御gmpr-1基因克隆具体为先配制包含大豆品系wiliams82基因组dna模板1μl、2×phanta max buffer 25μl、10mm的dntp 2μl、10μlm的引物pr-1-f 1.5μl、10μlm的引物pr-1-r 1.5μl、phanta max super-fidelitydna polymerase 1μl和无菌去离子水18μl的总体积为50μl的反应体系，随后将反应体系放入pcr仪中进行pcr扩增得到gmpr-1基因。
4、进一步改进在于：所述pcr扩增处理过程为现在95℃条件下反应5min，随后以95℃、30s，55℃、30s，72℃、1min进行35次循环，最后在72℃条件下反应10min即完成pcr扩增处理。
5、进一步改进在于：所述引物对中引物pr-1-f的核苷酸序列如seq id no.3所示，引物pr-1-r的核苷酸序列如seq id no.4所示。
6、一种大豆免疫防御基因在提高共生结瘤和固氮能力方面的应用，包括以下步骤：
7、步骤一、植物过表达载体的构建，先使用引物对pub-pr-1-f/r对大豆品系wiliams82基因组dna进行扩增得到两端带有部分载体pub-gfp同源区段的gmpr-1片段，随后使用同源重组的方法将片段连接到pub-gfp载体上，得到植物过表达载体pub-gfp：：gmpr-1；
8、步骤二、大豆种子萌发处理，先采用氯气对大豆种子进行灭菌，随后将其播种于蛭石中培养，得到萌发大豆；
9、步骤三、菌膜培养，将植物过表达载体通过电转的方法导入农杆菌k599中，并用引物对pub-f/r通过pcr的方法筛选得到阳性转化子，随后对阳性转化子进行培养得到菌膜；
10、步骤四、侵染处理，在萌发大豆的下胚轴沿45°斜切，随后将菌膜处理成膏状，将斜切后的萌发大豆蘸取膏状菌膜后，沿斜切面将大豆放入无氮固体fm培养基中培养2-3天后，再将大豆取出，放入有氮固体fm培养基中培养3-4天；
11、步骤五、毛根培养及鉴定筛选，将侵染处理培养后的植物取出，去除切面愈伤组织处长出的根后在有氮液体fm培养基中培养5-6天，随后取出植物并检测阳性根并去除非阳性根，然后继续培养接菌；
12、步骤六、鉴定及表型分析，在接菌培养28天后对毛根转化植株的共生表型进行考察，并使用qrt-pcr的方法用引物对qpcr-pr-1-f/r对根瘤中gmpr-1基因的表达量进行分析。
13、进一步改进在于：所述步骤一中引物对pub-pr-1-f/r中的引物pub-pr-1-f的核苷酸序列如seq id no.5所示，引物pub-pr-1-r的核苷酸序列如seq id no.6所示。
14、进一步改进在于：所述步骤六中引物对qpcr-pr-1-f/r中的引物qpcr-pr-1-f的核苷酸序列如seq id no.7所示，引物qpcr-pr-1-r的核苷酸序列如seq id no.8所示。
15、本专利技术的有益效果为：本专利技术提出的大豆病程相关基因gmpr-1是一个编码参与植物免疫防御反应核心蛋白的基因，并且通过过表达gmpr-1，能够影响豆科植物在根瘤菌侵染时触发的早期免疫防御反应，进而提高共生结瘤和固氮能力，也能够增加单颗根瘤的瘤重和大小，提高大豆根瘤总重量和植株地上部分生物量，为豆科植物的氮高效和分子育种提供基因资源，为大豆-根瘤菌的组合利用及应用提供分子改造技术，从而服务于环境友好型的绿色可持续农业的发展。
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1.一种大豆免疫防御基因，其特征在于：包括所述大豆免疫防御GmPR-1基因从大豆品系Wiliams82中使用引物对PR-1-F/R克隆获得，所述GmPR-1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述GmPR-1蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的一种大豆免疫防御基因，其特征在于：所述大豆免疫防御GmPR-1基因克隆具体为先配制包含大豆品系Wiliams82基因组DNA模板1μl、2×Phanta MaxBuffer 25μl、10mM的dNTP 2μl、10μlM的引物PR-1-F 1.5μl、10μlM的引物PR-1-R 1.5μl、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μl和无菌去离子水18μl的总体积为50μl的反应体系，随后将反应体系放入PCR仪中进行PCR扩增得到GmPR-1基因。
3.根据权利要求2所述的一种大豆免疫防御基因，其特征在于：所述PCR扩增处理过程为现在95℃条件下反应5min，随后以95℃、30s，55℃、30s，72℃、1min进行35次循环
4.根据权利要求1所述的一种大豆免疫防御基因，其特征在于：所述引物对中引物PR-1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，引物PR-1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
5.一种大豆免疫防御基因在提高共生结瘤和固氮能力方面的应用，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的一种大豆免疫防御基因在提高共生结瘤和固氮能力方面的应用，其特征在于：所述步骤一中引物对pUB-PR-1-F/R中的引物pUB-PR-1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，引物pUB-PR-1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
7.根据权利要求5所述的一种大豆免疫防御基因在提高共生结瘤和固氮能力方面的应用，其特征在于：所述步骤六中引物对qPCR-PR-1-F/R中的引物qPCR-PR-1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，引物qPCR-PR-1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
...【技术特征摘要】
1.一种大豆免疫防御基因，其特征在于：包括所述大豆免疫防御gmpr-1基因从大豆品系wiliams82中使用引物对pr-1-f/r克隆获得，所述gmpr-1基因核苷酸序列如seq id no.1所示，所述gmpr-1蛋白质氨基酸序列如seq id no.2所示。
2.根据权利要求1所述的一种大豆免疫防御基因，其特征在于：所述大豆免疫防御gmpr-1基因克隆具体为先配制包含大豆品系wiliams82基因组dna模板1μl、2×phanta maxbuffer 25μl、10mm的dntp 2μl、10μlm的引物pr-1-f 1.5μl、10μlm的引物pr-1-r 1.5μl、phanta max super-fidelity dna polymerase 1μl和无菌去离子水18μl的总体积为50μl的反应体系，随后将反应体系放入pcr仪中进行pcr扩增得到gmpr-1基因。
3.根据权利要求2所述的一种大豆免疫防御基因，其特征在于：所述pcr扩增处理过程为现在95℃条件下反应5min，随后以95℃、30s，55℃、30s...
【专利技术属性】
技术研发人员：李友国，南翔，马明月，李梓奇，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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