【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物学领域和植物基因工程技术，具体为一个调控大豆下胚轴伸长和叶面积大小的基因gmerectab及其编码蛋白与应用。
技术介绍
1、
2、大豆密植和间套作模式在土地资源利用与提高单位土地面积上群体生物量等方面具有显著的作用。2020年中央一号文件指出，要加大对玉米和大豆间作新农艺推广的支持。玉米是重要的青储原料，生物量高但其蛋白质含量较低。大豆则具有较高的蛋白质含量但生物量低。将大豆与玉米混合作为青储原料可以有效弥补单一以玉米作为青储原料的缺点。因此提高大豆生物量将进一步提高大豆作为青储原料的优势，具有较高的经济效益，对农业可持续发展具有重要意义。
技术实现思路
1、
2、本专利技术提供一个调控大豆下胚轴伸长和叶面积大小的基因gmerectab及其编码蛋白与应用，通过过量表达gmerectab基因的基因组全长序列ggmerectab可以显著增加荫蔽下大豆的下胚轴长度和叶面积大小。本专利技术通过以下技术方案来实现：
3、一种调控荫蔽下大豆株型的基因，所述基因来自大豆ggmerectab的基因组全长序列，其基因组全长核苷酸序列为seq id no.1，其全长编码序列为seq id no.2。进一步的，所述ggmerectab氨基酸序列如seq id no.3 所示。方案包括以下步骤：
4、载体构建：
5、a. 采用分段扩增将ggmerectab全长分为两次独立的基因扩增事件；
6、b. 对从起始密码子a
7、primer1 seq id no.4：5’- tacgaacgatagccggtaccatggcgtttcggtttggac-3’；
8、primer2 seq id no.5：3’- tgtagtccaccactttgtacagcccgggactagcttcggaggtgagtaa-5’
9、c. 对这5082个碱基长度的扩增产物进行胶回收，并通过无缝连接克隆将该片段构建到pbf载体上，得到pbf-ggmerectab-5082；
10、d. 对从起始密码子atg开始的第5083-7238位核苷酸序列进行扩增：
11、primer3 seq id no.6：5’- ttactcacctccgaagctagtgattcttcacattaatatgacacttc-3’；
12、primer4 seq id no.7：3’- gtagtccaccactttgtacaggtgactattttgtgatattacttc-5’
13、e. 对这2156个碱基长度的扩增产物进行胶回收，并通过无缝连接克隆将这2156个碱基对构建在pbf-ggmerectab-5082上，得到pbf-ggmerectab-flag重组质粒。
14、f. 将重组质粒通过热激转化方法导入大肠杆菌dh5α，将菌液涂布到含有50 μg/ml kanamycin的lb固体培养基上，37℃过夜培养，菌落pcr鉴定和酶切鉴定为阳性克隆后，挑取阳性克隆到含有50 μg/ml kanamycin液体lb培养基中，37℃过夜振荡培养，用试剂盒提取质粒，质粒酶切鉴定后测序；其菌落pcr鉴定所用引物为：
15、primer5 seq id no.8：5’- caaacgaatctcaagcaatc-3’；
16、primer6 seq id no.9：3’- acctagtcatttgtcgtcatcgt-5’
17、其酶切鉴定体系为：neb cut smart buffer 1μl；bsp1407i 0.1μl；重组质粒pbf-ggmerectab-flag 8.9μl，于37℃水浴中反应4h。
18、g. 质粒测序正确后，将质粒转化农杆菌eha105，涂到50 μg/ml kanamycin+25 μg/ml rifampicin lb固体培养基上，28℃培养2d，菌落pcr鉴定为阳性克隆后于终浓度为15％的甘油中保存该菌种。
19、在大豆中过表达ggmerectab：
20、a. 农杆菌活化：
21、将保存于-80℃冰箱的菌液扩大培养，测菌液吸光度od650＝0.8-1可用于后续操作；
22、b. 侵染液制备：
23、于3500rpm 10min收集菌液，之后用侵染培养基重悬浮，使之od650=0.6左右。用无菌的250ml锥形瓶每瓶50ml左右分装侵染液，保存在超净台，使用前放入摇床60rpm 30min后再使用。
24、c. 挑取健康的大豆种子，均分子叶，去除真叶，在子叶节处进行创伤。将制备好的外植体放于侵染液中。侵染完成后，于协同培养基培养5天。
25、d. 使用冲洗培养基先进行冲洗，之后吸干液体，将外植体伤口朝上插入芽诱导培养基，放入培养箱培养4周，两周换一次培养基。
26、e. 将四周后的芽诱导材料转移到芽伸长培养基中，此阶段培养8周，芽至少长到3厘米以上可进行根诱导。当诱导出2-3条根时，便可以进行驯化。
27、f. 在驯化苗新的复叶完全展开后，用草甘膦溶液涂抹叶片，检测其是否有除草剂抗性，对具有抗性的叶片进行western blot检测ggmerectab-flag融合蛋白表达情况，提取叶片gdna并检测tdna插入情况，检测所用引物同菌落pcr鉴定中的引物一致。
28、荫蔽下ggmerectab过表达材料的表型鉴定
29、a. 大豆萌发与种植：
30、将种子用湿润纱布包裹，于25℃萌发两天，两天后挑取长势一致的幼苗移栽到营养土中于白光(wl)下继续生长，直至幼苗破土。
31、b. 大豆荫蔽处理：
32、幼苗破土后，将幼苗分别放置于正常光(wl)和荫蔽条件(shade)下生长至v1期，之后观察下胚轴和叶面积表型变化，并统计下胚轴长度和叶面积大小。如图1、2所示。荫蔽下，ggmerectab过表达材料35s::ggmerectab-flag的下胚轴长度和叶面积大小均显著大于对照。
33、有益效果：
34、本专利技术公开了一个调控大豆下胚轴伸长和叶面积大小的基因gmerectab及其编码蛋白与应用，通过对gmerectab的基因组序列ggmerectab 7238 bp进行扩增，并采用无缝连接方法进行载体重组，高效得将ggmerectab的基因组全长序列克隆到pbf载体上；通过bar标记基因赋予转化受体的除草剂抗性筛选，以及western blot检测ggmerectab-flag融合蛋白表达，确保阳性苗能准确快速检出，阳性苗筛选到t3代纯合，无分离情况出现，避免假阳性干扰。本专利技术gmerectab对荫蔽下大豆下胚轴伸长和叶面积大小调控效果显著，结果准确可靠，调控方法操作简单，方便，可公式化，易于推广应用本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一个调控大豆下胚轴伸长和叶面积大小的基因GmERECTAb及其编码蛋白与应用，其特征在于，通过将表达载体pBF-gGmERECTAb-FLAG导入大豆中过量表达GmERECTAb基因的基因组全长序列gGmERECTAb可以显著增加荫蔽下大豆的下胚轴长度和叶面积大小。
2.如权利要求1所示，一个调控大豆下胚轴伸长和叶面积大小的基因GmERECTAb及其编码蛋白与应用，其特征在于：pBF-gGmERECTAb-FLAG重组载体构建中所用的方法为无缝连接克隆，方法步骤如下：
3.如权利要求1所示，一个调控大豆下胚轴伸长和叶面积大小的基因GmERECTAb及其编码蛋白与应用，其特征在于：将pBF-gGmERECTAb-FLAG重组载体转化到大豆中采用的是农杆菌介导转化大豆子叶结的方法，方法包括以下步骤：
4.如权利要求2所述，一个调控大豆下胚轴伸长和叶面积大小的基因GmERECTAb及其编码蛋白与应用，其特征在于：步骤A中gGmERECTAb基因组全长序列为SEQ ID NO.1 。
5.如权利要求2所述，一个调控大豆下胚轴伸长和叶面积
6.如权利要求2所述，一个调控大豆下胚轴伸长和叶面积大小的基因GmERECTAb及其编码蛋白与应用，其特征在于：步骤F中菌落鉴定所用的引物如下：
7.如权利要求2所述，一个调控大豆下胚轴伸长和叶面积大小的基因GmERECTAb及其编码蛋白与应用，其特征在于酶切鉴定的位点选择和酶切体系如下：酶切位点：Bsp1407I
8.如权利要求3所述，一个调控大豆下胚轴伸长和叶面积大小的基因GmERECTAb及其编码蛋白与应用，其特征在于：载体pBF的C端含有FLAG标签；所述pBF-gGmERECTAb-FLAG重组载体转化表达得到gGmERECTAb-FLAG融合蛋白；其全长编码序列为SEQ ID NO.2；其蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.3。
9.如权利要求3所述，一个调控大豆下胚轴伸长和叶面积大小的基因GmERECTAb及其编码蛋白与应用，其特征在于：步骤A中菌种活化，首先将原始菌种在50 μg/mL kanamycin+50μg/mL streptomycin LB固体培养基上涂布，28℃培养2天后，挑取单菌落到50 μg/mLkanamycin+25 μg/mL rifampicin LB液体培养基上扩大培养，当菌液吸光度OD650＝0.8-1可用于后续操作。
...【技术特征摘要】
1.一个调控大豆下胚轴伸长和叶面积大小的基因gmerectab及其编码蛋白与应用，其特征在于，通过将表达载体pbf-ggmerectab-flag导入大豆中过量表达gmerectab基因的基因组全长序列ggmerectab可以显著增加荫蔽下大豆的下胚轴长度和叶面积大小。
2.如权利要求1所示，一个调控大豆下胚轴伸长和叶面积大小的基因gmerectab及其编码蛋白与应用，其特征在于：pbf-ggmerectab-flag重组载体构建中所用的方法为无缝连接克隆，方法步骤如下：
3.如权利要求1所示，一个调控大豆下胚轴伸长和叶面积大小的基因gmerectab及其编码蛋白与应用，其特征在于：将pbf-ggmerectab-flag重组载体转化到大豆中采用的是农杆菌介导转化大豆子叶结的方法，方法包括以下步骤：
4.如权利要求2所述，一个调控大豆下胚轴伸长和叶面积大小的基因gmerectab及其编码蛋白与应用，其特征在于：步骤a中ggmerectab基因组全长序列为seq id no.1 。
5.如权利要求2所述，一个调控大豆下胚轴伸长和叶面积大小的基因gmerectab及其编码蛋白与应用，其特征在于：步骤b和步骤d中两次独立的基因扩增中所用的引物如下：
【专利技术属性】
技术研发人员：杜俊波，蒋亨珂，王向前，廖树琳，罗芮洁，母德伟，刘昱含，孙歆，杨辉，余靓，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：
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