【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域和重组卡介苗（rbcg）开发，具体地说，涉及一种结核病疫苗重组卡介苗及其制备方法和应用。
技术介绍
1、结核病（tb）是由结核分枝杆菌（mtb）引起的一种严重的呼吸道传染病。根据世界卫生组织《2022年全球结核病报告》，全球约有1060万新登记的结核病病例，人类免疫缺陷病毒（hiv）阴性人群的结核病死亡人数达到140万，另有hiv阳性人群死亡18.7万。此外，据估计，世界人口中约有四分之一患有潜伏性结核感染（ltbi）。
2、卡介苗（ bacille calmette-guérin，bcg）是目前全球唯一临床用结核病疫苗，可以有效预防新生儿粟粒型结核病和结核性脑膜炎的发病。但研究发现，卡介苗对学龄期儿童仅具有中度保护作用，保护效力为44%~99%不等。因此，需要增强卡介苗的免疫保护效果，获得更有效的新型结核病疫苗。
3、构建重组卡介苗（recombinant bcg，rbcg）是一种可以有效提高bcg保护效果的方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一株提高市售卡介苗性能，预防结核病感染的疫苗，可作为：成人用卡介苗；替代卡介苗初始免疫的疫苗。本专利技术使用重组或者过表达结核分枝杆菌o-甘露糖基转移酶构建重组bcg增加bcg免疫作用。
2、本专利技术的另一个目的是提供上述疫苗的一种制备方法。
3、本专利技术提供了一种重组卡介苗疫苗，其为重组卡介苗rbcg
4、本专利技术中重组的 rv1002c( 1512bp, mtci237.17c)，表达结核分枝杆菌的o-甘露糖基转移酶，可以催化第一个甘露糖基连接到蛋白质多肽链的ser或thr残基上，再经甘露糖基转移酶或其他糖基转移酶延长糖链。在蛋白质的o-甘露糖基化功能研究中, 蛋白质的o-甘露糖基化修饰不仅可以影响蛋白质的水解及定位，也参与致病菌与宿主相互作用。过表达rv1002c会促进bcg的糖蛋白表达，使其更易被肺部的巨噬细胞及树突状细胞吞噬，促进适应性免疫应答被激活，从而发挥更有效的疫苗作用。本专利技术将上述基因与载体pmv261重组，并在bcg中表达，形成重组卡介苗rbcg-rv1002c。
5、另一方面，本专利技术提供了上述重组卡介苗疫苗的制备方法，包括以下步骤：
6、（1）扩增结核分枝杆菌o-甘露糖基转移酶rv1002c基因；
7、（2）分别用双酶切rv1002c序列和pmv261表达载体，胶回收连接形成重组质粒；
8、（3）将重组质粒电转进入bcg感受态中，培养，筛选能够稳定过表达菌株；
9、（4）将步骤（3）筛选的菌株，进行扩大培养，在小鼠体内进行传代活化，保种，即形成重组卡介苗rbcg-rv1002c。
10、本专利技术进一步提供上述重组卡介苗疫苗作为用于结核分枝杆菌感染的预防和治疗的初免疫苗、加强疫苗或者治疗性疫苗的应用。
11、和现有技术相比，本专利技术具有下列优势:
12、本专利技术通过在bcg中过表达编码o-甘露糖基转移酶rv1002c，以提高bcg中抗原的糖基化水平，增强bcg的免疫原性；rbcg-rv1002c疫苗使用穿梭质粒 pmv261 融合表达结核杆菌o-甘露糖基转移酶rv1002c，促进菌体的糖蛋白的表达，并有效激活巨噬细胞，诱导适应性免疫应答的产生。
13、本专利技术研究发现，免疫6周龄c57bl/6雌性小鼠后，该重组卡介苗bcg-rv1002c在免疫学水平检测上同对照组和bcg疫苗组相比，可以显著促进巨噬细胞表面的mhc分子等表达，激活巨噬细胞的呈递功能，同时提高小鼠外周血中cd4+，cd8+ t淋巴细胞的比例，cd4+，cd8+ t淋巴细胞在抗结核免疫过程中均有重要作用。也进一步提高了小鼠的免疫水平，能够显著的降低小鼠肺部细菌数量。因此，该重组卡介苗bcg-rv1002c有可能成为一种有效的新的重组卡介苗用于结核分枝杆菌感染的预防和治疗。
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1.一种重组卡介苗疫苗，其特征在于，其为重组卡介苗rBCG-Rv1002c，通过将结核分枝杆菌O-甘露糖基转移酶Rv1002c与穿梭质粒pMV261连接，使O-甘露糖基
2.一种根据权利要求1所述的重组卡介苗疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，使用BamHI和HindIII双酶切。
4.一种根据权利要求1所述的重组卡介苗疫苗作为用于结核分枝杆菌感染的预防和治疗的初免疫苗、加强疫苗或者治疗性疫苗的应用。
【技术特征摘要】
1.一种重组卡介苗疫苗，其特征在于，其为重组卡介苗rbcg-rv1002c，通过将结核分枝杆菌o-甘露糖基转移酶rv1002c与穿梭质粒pmv261连接，使o-甘露糖基
2.一种根据权利要求1所述的重组卡介苗疫苗的制备方法，其特征在于，包括以...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐颖，翁术锋，张天然，王洪海，张文宏，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：
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