【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及动物模型领域，具体涉及用于建立原发性肝癌小鼠模型的突变基因，还涉及将该突变基因用于建立原发性肝癌小鼠模型，还涉及建立原发性肝癌小鼠模型的方法。
技术介绍
1、动物模型是研究人类疾病发病机制和开发治疗药物的重要工具。小鼠因具有与人类基因组高度相似、培育成本较低、基因修饰易于实现等优势，被公认为是研究肿瘤最理想的模式动物之一。因此，肝癌实验动物模型是探索肝癌发病机制、筛选鉴定潜在药物靶点、开展临床前研究的必要材料。
2、目前已有多种小鼠肝癌模型应用于肝癌研究，如化学诱导模型、人类肝癌组织或癌细胞的异种移植模型，现在已有造模方式存在周期长、成功率低、模型动物遗传背景修改较大，其中化学诱导方式的药物毒性过大、成功率约50％左右，对于化学诱导模型，其dna突变存在很大异质性，癌症发生周期至少长达数月甚至一年。常用的肝癌化学诱导剂包括：二乙基亚硝胺(den)、黄曲霉素b1(afb1)、四氯化碳(ccl4)等，通过饮食、灌胃、吸入气体、腹腔注射或皮下注射等，从幼年时期(出生第14天)诱导小鼠在较长周期中形成肝癌，且化学诱导肝癌模型小鼠起病隐匿、病死率高、导致成功率较低，且小鼠肝癌病灶出现的时间、解剖部位、病灶数量等异质性较大。异种移植采用辐照或降低免疫防御等方式，导致动物免疫背景修饰过大，对肝癌疾病的模拟重现能力低；常见的移植性肝癌模型主要分为两种，一种是将人源的肝癌细胞系接种到免疫缺陷小鼠体内，称为cdx(cell derived xenograft)模型，另一种是将来源于患者的肝癌组织块接种到免疫缺陷小鼠体内，称
3、基因工程小鼠是一种成功率较高的模式动物制作方式，但既往的敲入或敲除过程较为繁琐，周期长达数年，且大多在动物未发育时改变遗传背景的方式，难以模拟成年人罹患肝癌的发病时机和过程，例如在动物妊娠过程中，特异性过表达肝脏癌基因c-myc和其他基因，成瘤时间为生产后2月龄，此方法造模成本高、耗时长、且成瘤率不均一；在评价相关基因在肝癌发生和发展过程中的作用时，还需要与相关基因小鼠进行合笼，从f0过渡到f2代方能启动评估，该过程显著增加了转基因原发性肝癌小鼠模型时间和经济成本。
4、因此，亟需一种成瘤时间快，操作简单的小鼠肝癌模型制作方法，对肝癌发生发展的分子机制探索、新型生物标记物的寻找、新药和靶向药物的开发等具有重要意义。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种用于建立原发性肝癌小鼠模型的突变基因；本专利技术的目的之二在于提供用于建立原发性肝癌小鼠模型的突变基因组合；本专利技术的目的之三在于提供突变基因组合联合干扰小鼠tp53表达的试剂在建立原发性肝癌小鼠模型中的应用；本专利技术的目的之四在于提供一种原发性肝癌小鼠模型的建立方法。
2、为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、1、用于建立原发性肝癌小鼠模型的突变基因，所述突变基因包括小鼠akt1在内的突变基因。
4、2、用于建立原发性肝癌小鼠模型的突变基因组合，所述突变基因组合包括小鼠akt1基因的突变基因和小鼠nras基因的突变基因。
5、本专利技术优选的，所述小鼠akt1基因的突变基因为小鼠akt1基因c.49g>a；p.e17k；所述小鼠nras基因的突变基因为小鼠nras基因c.35g>a；p.g12d、c.38g>a；p.g13d、c.182a>g；p.q61r。
6、本专利技术优选的，所述小鼠akt1基因的突变基因序列如seq id no.1所示；所述小鼠nras基因的突变基因如seq id no.12所示。
7、3、所述突变基因组合联合干扰小鼠tp53表达的试剂在建立原发性肝癌小鼠模型中的应用。
8、本专利技术优选的，所述干扰小鼠tp53表达的试剂为pt2-shp53载体。
9、4、一种原发性肝癌小鼠模型的建立方法，将权利要求1所述突变基因或权利要求2所述突变基因组合与干扰小鼠p53表达的试剂和表达转座子酶的载体混合为混悬液，通过尾静脉注射混悬液即可。
10、本专利技术优选的，所述注射剂量按体积质量比为20μl/g～100μl/g注射。
11、本专利技术优选的，所述表达转座子酶的载体为pcmv(cat)t7-sb100载体。
12、本专利技术的有益效果在于：本专利技术公开了用于建立原发性肝癌小鼠模型的突变基因，通过尾静脉注射突变基因诱导小鼠发生自发性原位肝癌，相比现有模型，能更好地模拟人体肝癌发生，原因有三：一是在小鼠性成熟后造模，可避免基因转染对小鼠胚胎发育的影响，相比基因工程小鼠和化学诱导模型，高度模拟了与人肝癌发生的年龄状态，避免了对模型基础遗传背景的过多干预；二是可同时转入多个癌基因，更好地模拟人肝癌发生的多基因突变的特点；三是造模选用的都是免疫完整型小鼠，无移植瘤小鼠模型所用的免疫缺陷型小鼠的特点，与健康人体从肝癌发生到发展的免疫进程基本保持一致性。因此，利用尾静脉注射携带突变基因的混合质粒诱导自发性原位肝癌技术能很好地模拟肝癌生发和进程，操作简单且易于获取，成功率高且稳定，对于肝癌发生发展的分子机制探索、新型生物标记物的寻找、新药和靶药物的开发等具有重要意义。
13、进一步，本专利技术还具有构建出成功率高(接近100％)、发癌周期短(3周内)、意外死亡率低、适用品系广(包括但不限于c57bl/6j、fvb/n、dba/2三种品系)等优点。
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1.用于建立原发性肝癌小鼠模型的突变基因，其特征在于：所述突变基因包括小鼠AKT1在内的突变基因。
2.用于建立原发性肝癌小鼠模型的突变基因组合，其特征在于：所述突变基因组合包括小鼠AKT1基因的突变基因和小鼠NRAS基因的突变基因。
3.根据权利要求2所述用于建立原发性肝癌小鼠模型的突变基因组合，其特征在于：所述小鼠AKT1基因的突变基因为小鼠AKT1基因c.49G>A；p.E17K；所述小鼠NRAS基因的突变基因为小鼠NRAS基因c.35G>A；p.G12D、c.38G>A；p.G13D、c.182A>G；p.Q61R。
4.根据权利要求2所述用于建立原发性肝癌小鼠模型的突变基因组合，其特征在于：所述小鼠AKT1基因的突变基因序列如SEQ ID NO.1所示；所述小鼠NRAS基因的突变基因如SEQID NO.12所示。
5.权利要求2所述突变基因组合联合干扰小鼠TP53表达的试剂在建立原发性肝癌小鼠模型中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述干扰小鼠TP53表达的试剂为pT2
7.一种原发性肝癌小鼠模型的建立方法，其特征在于：将权利要求1所述突变基因或权利要求2所述突变基因组合与干扰小鼠P53表达的试剂和表达转座子酶的载体混合为混悬液，通过尾静脉注射混悬液即可。
...【技术特征摘要】
1.用于建立原发性肝癌小鼠模型的突变基因，其特征在于：所述突变基因包括小鼠akt1在内的突变基因。
2.用于建立原发性肝癌小鼠模型的突变基因组合，其特征在于：所述突变基因组合包括小鼠akt1基因的突变基因和小鼠nras基因的突变基因。
3.根据权利要求2所述用于建立原发性肝癌小鼠模型的突变基因组合，其特征在于：所述小鼠akt1基因的突变基因为小鼠akt1基因c.49g>a；p.e17k；所述小鼠nras基因的突变基因为小鼠nras基因c.35g>a；p.g12d、c.38g>a；p.g13d、c.182a>g；p.q61r。
4.根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：李世峰，李艳玲，
申请(专利权)人：成都建木起源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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