【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于农业微生物检测领域，具体涉及一种检测土壤中耐盐芽孢杆菌丰度的特异性引物及其检测方法和应用。
技术介绍
1、土传病害具有很强的传染性、暴发性和毁灭性。主要由于病原菌在土壤中越冬，很难被杀死，来年继续危害作物，循环反复，病害越来越严重。目前，土传病害的防治主要依靠大量使用化学农药，化学农药的广泛使用会导致许多环境问题，如土壤恶化、养分比例失衡或水污染等。使用更环保的肥料取代化学肥料迫在眉睫。
2、随着人们对环境的重视，对于环境友好型的生防菌剂的需求逐渐增加，在防治实践上，一大批有益菌已被筛选和改良，并在生产上得以应用。生防菌在田间应用最关键的是能适应各种复杂的土壤环境，在植物的根际稳定定殖。耐盐芽孢杆菌(bacillushalotolerans)可在温度为5℃～45℃、ph5-10条件下生长，具有较强的耐盐能力，高盐条件下也可以正常的生长和定殖，具有良好的抗逆性。研究表明，耐盐芽孢杆菌能够强烈的抑制多种病原菌的菌丝生长和孢子形成，具有广谱性，并且可促进植物的生长，增加植物的抗逆性。
3、目前，还没有关于检测耐盐芽孢杆菌在植物根际定殖的特异性引物的报导，主要依靠传统平板计数的方法，这种方法不仅费时、耗力，还因土壤环境和平板培养的条件差距导致计数不准确。因此，本专利技术根据实验室自主筛选的耐盐芽孢杆菌lnu-w20的全基因组数据，筛选到一个特异性引物序列，并检测其特异性和灵敏度，可实时观测植物根际耐盐芽孢杆菌的动态变化，及时调整菌株的使用量，让其发挥更好的作用。
技术实现
1、本专利技术的目的在于提供一种检测土壤中耐盐芽孢杆菌丰度的方法和应用，可实时观测耐盐芽孢杆菌在植物根际的定殖动态。
2、本专利技术采用的技术方案是：
3、一种检测土壤中耐盐芽孢杆菌丰度的特异性引物，由上游引物序列w2f：acgccaagcgggtcaacgat和下游引物序列w2r：tggatgcggcaaggagattc组成。
4、上述的特异性引物检测土壤中耐盐芽孢杆菌丰度的检测方法，包括如下步骤：
5、1)提取耐盐芽孢杆菌bacillus halotolerans的基因组dna；
6、2)使用权利要求1所述的特异性引物扩增目的条带196bp；
7、3)将目的条带连接到t载体后，将质粒转化入大肠杆菌dh5α感受态细胞中，验证成功后提取质粒备用；
8、4)提取待测样本的总dna；
9、5)对待测样本总dna和步骤3)提取的质粒10倍梯度稀释进行qpcr扩增，通过将ct值和不同质粒dna浓度的对数作图，获得标准曲线，根据标准曲线计算待测样本中目的基因的拷贝数。
10、进一步的，上述的检测方法，步骤2)中，所述扩增目的条带使用vazyme lamp dnapolymerase，pcr反应体系为：
11、
12、pcr反应程序为：94℃5min预变性，94℃30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃彻底延伸10min。
13、进一步的，上述的检测方法，步骤3)中，所述t载体使用pmd 19t vector cloningkit，连接体系为：
14、
15、进一步的，上述的检测方法，步骤3)中，所述验证的方法为双酶切验证和t载体通用引物扩增。
16、更进一步的，上述的检测方法，所述双酶切位点选择克隆位点的上游和下游，使用hidⅲ和kpn1。
17、更进一步的，上述的检测方法，所述t载体通用引物序列为m13-47：agggttttcccagtcacg，m13-48：gagcggataacaatttcacac。
18、进一步的，上述的检测方法，步骤5)中，所述qpcr反应体系为：
19、
20、
21、qpcr反应程序为：95℃30s预变性，95℃10s，58℃退火30s，40个循环。
22、上述的检测土壤中耐盐芽孢杆菌丰度的特异性引物在制备检测耐盐芽孢杆菌试剂盒中的应用。
23、本专利技术的有益效果是：本专利技术根据耐盐芽孢杆菌lnu-w20的全基因组序列，在ncbi数据库中逐一比对，筛选到完全不匹配的特异性序列，设计到灵敏度高、特异性强的特异性引物，可大量迅速的检测土壤中耐盐芽孢杆菌的数量。
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1.一种检测土壤中耐盐芽孢杆菌丰度的特异性引物，其特征在于，所述的特异性引物由上游引物序列W2F：ACGCCAAGCGGGTCAACGAT和下游引物序列W2R：TGGATGCGGCAAGGAGATTC组成。
2.权利要求1所述的特异性引物检测土壤中耐盐芽孢杆菌丰度的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤2)中，所述扩增目的条带使用Vazyme LAmp DNA Polymerase，PCR反应体系为：
4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤3)中，所述T载体使用pMD19TVector Cloning Kit，连接体系为：
5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤3)中，所述验证的方法为双酶切验证和T载体通用引物扩增。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述双酶切位点选择克隆位点的上游和下游，使用HidⅢ和Kpn1。
7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述T载体通用引物序列为M13-47：AGGGTTTTCCCAG
8.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤5)中，所述qPCR反应体系为：
9.权利要求1所述的检测土壤中耐盐芽孢杆菌丰度的特异性引物在制备检测耐盐芽孢杆菌试剂盒中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种检测土壤中耐盐芽孢杆菌丰度的特异性引物，其特征在于，所述的特异性引物由上游引物序列w2f：acgccaagcgggtcaacgat和下游引物序列w2r：tggatgcggcaaggagattc组成。
2.权利要求1所述的特异性引物检测土壤中耐盐芽孢杆菌丰度的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤2)中，所述扩增目的条带使用vazyme lamp dna polymerase，pcr反应体系为：
4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤3)中，所述t载体使用pmd19tvector cloning kit，连接体系为：
<...【专利技术属性】
技术研发人员：朱春玉，王海霞，孟轩伊，王翔宇，韩传玉，李立梅，马晟闰，
申请(专利权)人：辽宁大学，
类型：发明
国别省市：
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