【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于合成生物学领域，具体地说，是一种3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸的合成方法。
技术介绍
1、自然的生物体内存在着各种各样的化学修饰反应，硫酸化反应就是其中一种，其对细胞或生物的发育、分化、免疫等生物学功能的发挥起到重要作用。在生物体中，大多数的硫酸化反应都是通过硫酸转移酶催化3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸(paps)的硫酸基团转移到特定底物中合成被硫酸化的代谢产物。
2、paps的生物合成方法主要包括发酵法(包括普通发酵和底物fed-batch全细胞催化合成)和生物酶法合成。
3、发酵法是通过引入外源基因对细胞基因组进行改造从而改造细胞的代谢途径，实现从底物atp到paps的转化。在正常生理条件下，细胞内绝大多数的atp都供给自身进行能量代谢，因此，细胞内实际可用的atp较少，这导致普通发酵法生产paps的转化率较低。cn112625995b公开了一种全细胞催化生产paps的方法，其利用分批添加atp底物，30℃催化反应15-16h，转化率可达96.12％。但多质粒转化可能会导致宿主负荷太大，致使细胞死亡，导致转化率下降或批反应间转化率不稳定。另外，由于细胞膜限制了细胞工厂对底物的摄取以及对产物的渗透，这使得该反应比使用酶法合成花费更长的时间。paps作为一种活性高能物质长时间暴露在室温条件下会迅速发生降解，这导致最终实际转化率下降。同时，发酵法由于发生的副反应较多而产生更多的副产物，后期分离纯化成本较高。
4、目前使用生物酶法合成paps的方法较为常见。生物酶法合成paps通常分
5、由于paps作为一种高能磷酸化合物，在体外不能稳定的长期保存，在生物体内也不容易大量蓄积，这为很多需要硫酸化的代谢产物的生产带来了一定的困难。目前商品化的paps价格昂贵(达7000元/5mg，targetmol)，无法满足大量生产需求。因此，构建稳定、高效的paps合成方法对硫酸软骨素、芥子油苷、肝素等化合物的工业化生物合成具有重要意义。
技术实现思路
1、针对目前体外酶法合成paps的方法存在转化率低，效率低的问题，本专利技术根据文献查找获得atp硫酸化酶、aps激酶以及无机焦磷酸酶的基因序列，下载其cds区序列，选择其催化结构域的部分序列，并对其进行密码子优化，然后选择合适的表达载体和宿主菌，构建atp硫酸化酶、aps激酶以及无机焦磷酸酶的基因表达载体；将上述表达载体转化宿主菌中，经过诱导表达、纯化以及鉴定，得到高纯度的atp硫酸化酶、aps激酶以及无机焦磷酸酶，并以此建立了酶法合成paps的反应体系。经过验证，本专利技术的反应体系能够高效合成paps。
2、因此，本专利技术的目的，就是提供一种稳定高效的体外酶法合成paps的方法，具体如下：
3、一种3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸的合成方法，其反应体系中包括atp硫酸化酶和aps激酶，分别用于催化以下两步反应：
4、1)atp硫酸化酶催化atp和so42-反应生成5′-腺苷磷酰硫酸；
5、2)aps激酶催化5′-腺苷磷酰硫酸生成3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸；
6、其中，所述合成方法的反应体系中还加入了无机焦磷酸酶，用于将atp硫酸化酶催化atp反应生成5′-腺苷磷酸硫酸的步骤中产生的焦磷酸降解为磷酸。
7、根据本专利技术的优选实施例，所述atp硫酸化酶的编码基因来源于kluyveromyceslactis.并经过密码子优化，优化的基因序列如seq id no.1所示。
8、根据本专利技术的优选实施例，所述aps激酶的编码基因来源于penicilliumchrysogenum.并经过密码子优化，优化的基因序列如seq id no.2所示。
9、根据本专利技术的优选实施例，所述无机焦磷酸酶的编码基因来源于escherichiacoli.并经过密码子优化，优化的基因序列如seq id no.3所示。
10、根据本专利技术的合成方法，所述反应体系包括：
11、反应缓冲液tris-hcl：20～60mm，so42-：5mm～100mm，atp：1mm～50mm，atp硫酸化酶：1.5μm～0.75mm，aps激酶：1.5μm～0.75mm，无机焦磷酸酶：1.5μm～0.75mm。
12、优选的，所述反应体系包括：
13、反应缓冲液tris-hcl：50mm，so42-：5mm，atp：10mm，atp硫酸化酶：7.5μm，aps激酶：7.5μm，无机焦磷酸酶：7.5μm。
14、进一步的，所述so42-的供体为硫酸钠或硫酸镁。
15、根据本专利技术的优选实施例，反应缓冲液tris-hcl的ph为8.0。
16、根据本专利技术的优选实施例，所述反应体系的温度为25～30℃。
17、根据本专利技术的优选实施例，反应时间为1小时。
18、本专利技术的3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸的合成方法具有以下有益效果：
19、1、本专利技术的方法可以在25～30℃的常温条件下进行，并且反应时间短，1个小时即可制备出大量paps，转化率达到80％以上，适合快速制备paps。
20、2、鉴于paps在体外不能稳定的长期保存(需要低温-80℃保存)，因此快速制备paps对于高产paps意义重大，渴望大幅降低paps的价格。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸的合成方法，其反应体系中包括ATP硫酸化酶和APS激酶，分别用于催化以下两步反应：
2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述ATP硫酸化酶的编码基因来源于Kluyveromyces lactis.并经过密码子优化，优化的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述APS激酶的编码基因来源于Penicillium chrysogenum.并经过密码子优化，优化的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述无机焦磷酸酶的编码基因来源于Escherichia coli.并经过密码子优化，优化的基因序列如SEQ ID NO.3所示。
5.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述反应体系包括：
6.根据权利要求5所述的合成方法，其特征在于，所述反应体系包括：
7.根据权利要求5或6所述的合成方法，其特征在于，所述SO42-的供体为硫酸钠或硫酸镁。
8.根据权利要求
9.根据权利要求5或6所述的合成方法，其特征在于，所述反应体系的温度为25～30℃。
10.根据权利要求5或6所述的合成方法，其特征在于，反应时间为1小时。
...【技术特征摘要】
1.一种3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸的合成方法，其反应体系中包括atp硫酸化酶和aps激酶，分别用于催化以下两步反应：
2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述atp硫酸化酶的编码基因来源于kluyveromyces lactis.并经过密码子优化，优化的基因序列如seq id no.1所示。
3.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述aps激酶的编码基因来源于penicillium chrysogenum.并经过密码子优化，优化的基因序列如seq id no.2所示。
4.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述无机焦磷酸酶的编码基因来源于escheric...
【专利技术属性】
技术研发人员：张明义，柳清霞，张帅，赵帅，陈煜乾，窦培冲，王少佩，苏敬允，钟远广，朱梦丹，张莲莲，
申请(专利权)人：铭诚惠众江苏药物研究有限公司，
类型：发明
国别省市：
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